β-LGで免疫したICRマウス、家兎、山羊の血清および3動物種に共通するβ-LGの主要抗体結合領域22-56、72-86、119-133、149-162残基目のアナログペプチドを用いた。ELISAを用いた免疫吸収法により同血清中抗β-LG抗体の詳細な結合部位(B細胞エピトープ)を調べたところ、ポリクローナル抗体を用いたにも関わらずほとんどのエピトープ領域が5-7アミノ酸残基まで限定化された。このことはβ-LG分子上動物種を通じて認識され易い領域のなかでも特に抗体の接近が容易な部分があり、その部分に高い特異性を持つB細胞のみが選ばれてきたことを意味している。同じ領域内においても動物種間では微妙に異なる部位がB細胞エピトープとして認識されており、各動物種に固有のB細胞レパートリーの影響あるいは各ハプロタイプのT細胞エピトープとB細胞エピトープとの位置関係の影響等を強く受けた結果と考えられた。

　抗原提示細胞内で生成したT細胞エピトープを含むペプチドは、アグレトープ部分でMHCクラスII分子と複合体を形成した後抗原提示細胞の表面に提示され、T細胞エピトープ部分を介して抗原特異的T細胞を活性化する。β-LGの全領域をカバーする合成部分ペプチドを用い、H-2ハプロタイプの異なる3系統のマウスBALB/c(H-2^d)、C3H/He(H-2^k)、C56BL/6(H-2^b)におけるT細胞エピトープの検索を行なった。β-LGで免疫したマウスのリンパ節細胞を採取し、ペプチド抗原存在下の増殖活性を³H-チミジンの取り込みを指標として測定した結果、BALB/cマウスはペプチド42-56、62-76、139-153を、C57BL/6マウスはペプチド11-26、72-86、100-113、119-133を、C3H/Heマウスはペプチド72-86、91-104、129-143、139-153をそれぞれ認識して増殖した。同定されたT細胞エピトープ領域はハプロタイプの異なる系統のマウス間で異なっており、唯一、ペプチド139-153がBALB/c(H-2^d)とC3H/He(H-2^k)に共通して認識された。このことは、各ハプロタイプのMHCクラスII分子の多型性により異なるペプチドフラグメントが提示された結果である他、各系統間で準備されているT細胞レパートリーが異なることも大きく影響していると考えられた。

　β-LGに特異的なT細胞の抗原認識とそれに伴う免疫応答を解析することを目的とし、β-LG特異的CD4⁺T細胞クローンを樹立してそれらの表面抗原、MHCクラスII分子拘束性、T細胞エピトープの解析を行なった。β-LGで免疫したBALB/cマウスのリンパ節および脾臓細胞を採取しin vitro抗原刺激を繰り返すことによってβ-LG特異的T細胞ラインを得た後、同細胞群から限界希釈法によりクローンを樹立した。β-LGに特異性を示すCD4⁺T細胞4クローン(H1.1、5G、2.11G、6.11G)を得た。これらはいずれもMHCクラスII分子の内I-A^d分子拘束的にβ-LGを認識して増殖した。特にH1.1および5GはBALB/cマウスにおける主要T細胞エピトープ42-56残基目を認識することから、in vivoにおけるβ-LGおよびβ-LG由來のペプチドフラグメントに対する免疫応答をよく反映すると期待される。すなわちこれらT細胞クローンはβ-LG特異抗体産生をはじめとする免疫応答に関わるT細胞・B細胞協同作用をin vitroで詳細に解析し、T細胞・B細胞エピトープフラグメントが果たす役割を一層深く理解するための有用な材料であると考えられた。

　B細胞は、細胞表面に抗原特異性を持つB細胞レセプターを表現している。B細胞レセプターの最も重要な機能は、抗原を効率よくとらえてプロセシングの経路に乗せることであると考えられているが、一方ではB細胞レセプターからのシグナル自体がB細胞の増殖に関わるという現象も示されている。ここでは一次構造上離れた部分のB細胞エピトープペプチド22-36とT細胞エピトープペプチド42-56を用いることによりプロセシングの過程を省略し、B細胞レセプターとT細胞からのシグナルを分離させて解析した。B細胞群はβ-LGで免疫したBALB/cマウスの脾臓細胞より調製し、T細胞はT細胞クローンH1.1を用いた。その結果ペプチド42-56はH1.1を活性化することにより単独でB細胞群の抗体産生を促した。また、ペプチド22-36はT細胞エピトープの存在下で抗ペプチド22-36抗体の産生を増強させた。すなわちB細胞エピトープフラグメントは単独では抗体産生に影響を及ほさないものの、T細胞エピトープフラグメントの存在下という条件の下で抗体産生を増強することが示された。

　CD4⁺T細胞は複数のサイトカインや細胞間接触を通じて様々な機能を発揮し、生体防御反応や炎症反応を制御している。β-LGなど食物アレルゲンに対する抗原特異的免疫応答を解析する際にも、抗体産生の補助・抑制、炎症の誘起や持続に関わる機能を解析することにより、アレルギー発症のしくみや消化管・皮膚などのアレルギー症状について免疫学的理解が深まると考えられる。特に炎症反応とその遷延化におけるCD4⁺T細胞の役割は大きいとされ、様々なアレルギー症状の緩和もCD4⁺T細胞を制御することにより可能となる場合も考えられる。ここではβ-LG特異的T細胞クローン4株についてそれらの多機能性をサイトカイン産生能、抗体産生補助機能、細胞傷害活性、遅延型過敏症反応(DTH反応)の誘導活性を指標に検討した。サイトカイン産生能はサイトカイン依存性細胞株を用いたバイオアッセイ、ヘルパー機能はin vitro抗体産生系、細胞障害機能は標的細胞からの³H-チミジンの遊離、DTH反応はマウス足しょの浮腫反応をそれぞれ指標として解析した。その結果、2.11Gと6.11Gは比較的高い細胞傷害活性とDTH反応誘起能からT_H1型であり、5Gは高い抗原特異的ヘルパー活性と低いDTH反応誘起能からT_H2型であると考えられた。H1.1はその中間的な機能を示した。

　T細胞クローンが多機能的に働くとすれば、実際の免疫応答の場において各々の機能は協同的・相乗的あるいは拮抗的に作用して生体内の変化を決定すると考えられる。本章では、BALB/cマウスの脾臓B細胞群において、活性化H1.1が多機能的に誘導または抑制する抗体応答を観察した。活性化H1.1は、未処理およびβ-LG免疫マウス由来の脾臓B細胞群において抗原非特異的に抗体産生を誘導した。高濃度のβ-LG抗原存在下では抗原特異的な抗体産生は抑制され、その傾向はβ-LGで免疫したマウス由来の細胞群において特に顕著であった。⁵¹Cr遊離法による細胞傷害試験の結果、抗体産生抑制の一因としてH1.1の細胞障害作用が関与していることが示唆された。単一T細胞クローンが抗原濃度に応じてin vitroで多機能的に働き、抗原特異的抗体産生を促進・抑制の両方向に制御する事象が示されたことより、生体における一個のT細胞の機能も、弾力性を持って発現されると推測される。すなわち抗原濃度、サイトカイン、他の細胞との接触など微小環境の条件によって各細胞の機能、ひいては免疫応答が方向付けられると考えられた。

　以上、本研究第1部では牛乳アレルゲンであるβ-LGのB細胞・T細胞エピトープを詳細に解析した。第2部ではβ-LG特異的T細胞クローンを樹立してその機能解析を行なった。また、T細胞クローンを用いた免疫応答のin vitroモデル系においてT細胞・B細胞エピトープフラグメントの機能について新たな知見を得、さらに単一T細胞クローンも微小環境に応じて多機能的に免疫応答の調節を行ない得ることを示した。

　本研究で得られた知見は、低抗原性化β-LGの分子設計等に役立つばかりでなく、広くβ-LGあるいは他抗原により引き起こされるアレルギー症状や免疫応答の基礎的知見として活用されることが期待される。また、本研究で得られたβ-LG特異的T細胞クローンおよび解析された多機能性は、今後もアレルギー症状における炎症反応等新しい情報を得るための有用な道具となることが期待される。