非極性充填剤のオクタデシル基結合(ODS)シリカにおける保持は、移動相の溶質に対する溶解力と相関があり、移動相がCO₂、N₂Oにかかわらず保持比の対数は溶解度の対数に対して一本の直線となる。この場合SFCは分配クロマトグラフィーに近い分離機構であり、また固定相の特性が移動相に影響されないという仮定が成立している。

　また、SFCおよびLCの溶質保持の理論において、移動相の保持に及ぼす影響には、溶質分子-溶媒分子間相互作用に基づく引力項と溶媒分子-溶媒分子間相互作用に基づく斥力項があり、後者は移動相中に溶質サイズの空間を作るエネルギーに関与している。通常のSFCの圧力条件(圧力30MPa以下)では溶質に対する斥力項は小さくなり、溶質分子-溶媒分子間相互作用の方が支配的となるため、SFCの保持は移動相密度の上昇によって低下する。一方、逆相LCのように移動相に極性液体が用いられる場合、溶媒分子間相互作用が大きいため、移動相中に溶質サイズの空間を作るエネルギーが保持の重要なdriving forceとなる。

　このことは、溶解パラメーターの概念を用いて半定量的に説明できる。溶解パラメーターは、単位体積当たりの凝集エネルギーの平方根として定義されており、溶解パラメーターの大きい物質ほど分子間相互作用が大きいことになる。ステアリン酸メチル(C₁₉H₃₈O₂)について、溶解パラメーターとSFC及びLCにおける保持の関係を図1に示す。油脂を対象とするSFC分離の場合、超臨界CO₂の溶解パラメーターが油脂の溶解パラメーターよりも小さい範囲で操作される。油脂の凝集エネルギーの方が超臨界流体の凝集エネルギーよりも大きいため、油脂が移動相に解けにくく固定相の方に保持される。移動相密度の増大によって超臨界流体の溶解パラメーターは油脂の溶解パラメーターに近付き、その結果、溶質の溶解度が増大し保持が低下する。一方、逆相LCでは、移動相液体の溶解パラメーターが溶質の溶解パラメーターよりも大きいところで操作される。移動相液体は凝集エネルギーが大きく油脂が溶けにくく、そのため固定相の方に保持される。このようにSFCと逆相LCでは移動相の保持への寄与が異なっている。

図1 SFC及びLCにおけるステアリン酸メチルの保持比k’移動相溶解パラメーターの関係。カラム:MTHV(ODS)、温度:313K(SFC),303K(LC).

　極性充填剤を用いたSFCの保持機構は、非極性充填剤における保持機構とは根本的に異なっており、一種の順相LCと捉えることができる。溶質が溶媒分子と吸着剤活性部をめぐって競合するというモデルを考慮すると、保持に重要となる移動相の特性は溶解力だけではなく、固定相への移動相分子の吸着性が重要になってくる。

　脂肪酸エステルの分離はその炭素数と二重結合数に依存する。極性充填剤のアミノプロピル基結合(NH₂)シリカを用いたSFCでは、炭素数が大きく二重結合の多いものほど溶出が遅れる。一方、非極性のODSシリカ充填剤では、炭素数が大きく二重結合の少ないものほど溶出が遅れる。図2に魚油由来の脂肪酸メチルエステルの分離挙動を示す。NH₂充填剤では、アミノプロピル基の結合量が大きくなると充填剤の極性が低下し、それと共にエステルの炭素数に対する選択性は増大し、一方二重結合数に対する選択性は減少する。このことから、二重結合数に対する選択性は充填剤の極性に依存し、炭素数に対する選択性はリガンドのプロピル基に由来すると考えられる。

図2 魚油由来の脂肪酸メチルエステルのSFCによる分離(10MPa,313K)。(A)カラム:Inertsil ODS(150×4.6mmI.D.)、移動相:CO₂,2.4g/min。(B)カラム:Cosmosil NH₂(150×4.6mmI.D.)、移動相:CO₂,2.5g/min。

　また、温度313K、圧力10〜30MPaの範囲では、炭素数1個に対する選択性はNH₂シリカで1.0〜1.05、ODSシリカで1.15〜1.2である。一方、二重結合1個に対する選択性はNH₂シリカで1.2〜1.3、ODS結合シリカで1.15〜1.18である。ODSカラムを固定相、アセトニトリルを移動相とする逆相LCの場合、二重結合数に対する選択性は1.5以上となり、SFCの場合よりも大きくなる。これは、アセトニトリル、メタノール等の極性溶媒はその極性相互作用または水素結合性相互作用のために、二重結合による溶質の僅かな極性の違いを捉え、高い選択性を示すためである。一方、CO₂は非極性のため溶質との相互作用は分散力だけであり、溶質の不飽和度の違いに基づく極性の差に対して選択性をほとんど示さない。

　トリグリセリドは、ODSシリカを充填剤とするクロマトグラフィーで相互分離することが出来る。しかしSFCの場合、移動相の極性が小さいため、充填剤表面に残留するシラノール基の吸着作用が保持に大きく影響し、ピークのテーリング、不溶出が観察されることが多い。そこで、トリグリセリドのシャープな分離が可能な、SFC用ODS充填剤の開発を行った。ODSシランによる反応の後、ゲルをトリメチルクロロシランで処理し、さらに気相のヘキサメチルジシラザンを用い573Kで24時間不活性化処理を行った。こうして得られたODSシリカでは、通常行われている液相での不活性化処理法と比べ飛躍的に吸着性が減少し、SFCにおいてシャープなトリグリセリドのピーク形状が得られた。糸状菌から抽出された油脂の分離例を図3に示す。また、比較のためLCでのクロマトグラムを合わせて図3に示す。

　天然の中性脂質には、構成脂肪酸の異なる多数のトリグリセリドが含まれている。図3で分離されたピークにはさらに分子種の異なるトリグリセリドが含まれており、規則的な溶出が見られる。トリグリセリドの溶出位置を示すため、ECN(equivalent carbon number)を導入した。飽和トリグリセリドのECNはそのアシル基の総炭素数で表され、不飽和トリグリセリドのECNは、その保持の大きさに対応する飽和トリグリセリドの炭素数として定義される。LCによる分離では、ECNが約2の間隔でピークが現れた。これは、糸状菌油脂、植物油脂の構成脂肪酸の多くは偶数の炭素数を持ち、また二重結合1個当たりのECNへの寄与が2に近いためである。SFCによる分離では、ピーク間隔はECNにして0.8〜1.0になる。短い間隔で溶出するのは、二重結合数のECNへの寄与が小さいためである。SFCとLCでは溶出挙動が異なることから、両者を組み合せることによって、トリグリセリドの高度の分子種分析が可能になると期待できる。

図3 糸状菌中性脂質のLC、SFCによる分離。カラム:ITHV(ODS)。LC:移動相acetone/acetonitrile(4:1),1.0mL/min。温度303K,RI検出器。SFC:移動相CO₂,1.8g/min。温度313K,圧力25MPa,UV検出器(210nm)。