大腸、直腸の大きさ25mm以下の隆起性腫瘍52例(Adenoma 47例、Carcinoma in Adenoma 4例、Invasive Carcinoma 1例)を対象にした。抗p53抗体として、p53蛋白N末端を認識するpAb1801、B17、C末端を認識するpAb421、G59-12、DO-10、HR231、p53蛋白中央部を認識しMutarlt p53蛋白特異的な抗体pAb240、および、N,C両末端を含む広い範囲を認識するポリクローナル抗体CM1を用いた。抗体に対する反応性、分子量、リン酸化の程度の異なる様々なp53Variantを検出するために、免疫組織化学のほか、ELISA、Western Blotting、O’Farrellの二次元ゲル電気泳動(等電点電気泳動+SDS-PAGE)を利用して蛋白解析を行った。また、Phosphatase処理によって、p53蛋白の脱リン酸化を促し、p53Variantとリン酸化の関係を検討した。p53遺伝子解析は、PCR-DGGEとDirect sequencingを組み合わせて行った。

　早期大腸癌5例中3例はELISAにてpAb421+/pAb1801+/pAb240+を示すp53蛋白を発現していた。そのうち2例のp53遺伝子を解析し、いずれにも点突然変異が認められた。一方、大腸腺腫47例中40例(85%)には、pAb1801+/pAb240-を示すp53蛋白発現が認められた。p53蛋白を発現している腺腫はすべて、ELISAにてpAb1801+を示したが、pAb240+を示した腺腫はなかった。大きさ11mm以上の腺腫、中等度異型腺腫では、p53蛋白を発現している頻度が有意に高率であった。しかし、大きさ10mm以下の腺腫56%(9/16)、軽度異型腺腫71%(15/21)においてもp53蛋白の発現がみられた。腺腫におけるp53遺伝子変異は認められなかった。免疫組織化学では、22例中3例(14%)の腺腫で部分的にp53蛋白の核内発現が認められた。Western Blottingによる解析から、ELISA plate上のpAb1801が捕えたp53蛋白中には、本来の分子量53kDを持つp53蛋白、"p53"に加え、分子量48kDを持つp53蛋白のVariant、"p48"が常に存在していることが明らかになった。しかし、p53蛋白C末端を認識する抗p53モノクローナル抗体、pAb421、DO-10、G59-12が捕えたp53蛋白中には"p53"のみが存在し、少数の例外を除いて"p48"は存在していなかった。さらに、pAb1801が捕えた"p53""p48"を二次元ゲル電気泳動によって解析したが、いずれにも等電点の異なるp53 Variant蛋白は検出されず、"p53""p48"いずれもほぼ同じ等電点位置にそれぞれ1スポットとして泳動していた。Phosphatase処理によるp53蛋白の変化は認められなかった。

　高感度のELISAにより、大腸腺腫において、Wild-type p53蛋白の発現が高頻度に生じていることが明らかになった。Wild-type p53蛋白発現は大きさ11mm以上の腺腫、または中等度異型腺腫で有意に高率に認められたが、大きさ10mm以下の軽度異型腺腫においても、40%(4/10)の症例で認められた。一方、早期大腸癌5例中3例はMutant p53蛋白を発現していた。大腸腺腫形成初期の段階で、Wild-type p53蛋白の発現が生じ、さらに、癌発生の早期段階でp53遺伝子変異が起こり、Mutant p53蛋白発現が導かれていると考えられる。腺腫におけるWild-type p53蛋白発現はなんらかの蛋白レベルの変異によって生じたものと考えられ、これはp53の機能の不活性化を反映している可能性がある。

　Wild-type p53蛋白を発現しているほとんどの大腸腺腫において、"p48"が認められた。本来より小さい分子量を持ち、C末端を認識する抗p53抗体に反応しない"p48"はC末端が切断されたp53蛋白である可能性が高い。p53蛋白のC末端部は、p53蛋白の核内への輸送に必要なNuclear Localization Signal、DNA結合Domain、p53蛋白同士の結合に必要なDomainなど、機能的に重要な部分を含んでおり、"p48"はC末端部が担う機能が不活性化されたp53蛋白であると考えられる。さらに、一部の腺腫では、Immunoreactivityや分子量の異なる特殊なp53Variantが発見された。多くの場合、p53蛋白のImmunoreactivityの変化はp53蛋白の機能の変化を反映している。大腸腺腫に発現している様々なp53Variantは機能的に異なるp53蛋白であると考えられる。

　p53蛋白の機能調節は、翻訳後のリン酸化によってなされている可能性が指摘されている。しかし、Phosphatase処理と二次元ゲル電気泳動を用いた今回の解析からは、リン酸化の程度の異なるp53 Variantは、大腸腺腫からは検出されず、また、異なるImmunoreactivityや分子量を持つp53 Variantとリン酸化の関係を示唆する結果も得られなかった。

　術前未治療の大腸、直腸癌59例、大腸癌の肝転移腫瘍3例を対象にした。ELISA、Western Blottingに加えて、PI(propidium iodide)とFITC(fluorescein isothiocyanate)の二重蛍光染色法を用いた2-パラメータFlow Cytometry(FCM)によって、腫瘍細胞核内のp53蛋白発現量とDNA量を同時測定した。個々の大腸癌におけるp53蛋白の発現パターン(その細胞内局在と抗体に対する反応性)、異なる分子量を持つp53蛋白のVariantを解析した。さらに、p53の発現と腫瘍の臨床病理学的因子、DNA indexとの関係を検討した。

　大腸癌は、FCMとELISAで解析したp53蛋白の発現パターンから、FCM、ELISAの両方でpAb421、pAb1801、pAb240すべてに陽性である腫瘍(Group A)、FCM、ELISAにおいて、pAb421、pAb1801、pAb240のうち、一部の抗体にのみ陽性を示す腫瘍(Group B)、p53蛋白発現が検出されない腫瘍(Group C)の三グループに分類することができた。p53蛋白発現と腫瘍Stage、腫瘍局在、DNAindexとの相関を調べたところ、FCM、ELISAにおけるp53蛋白発現はDNA index1.3以上の腫瘍と強い相関が認められた。FCMのpAb240陽性を示すp53蛋白発現と腫瘍Stageの間に有意な相関が認められたが、ELISAで検出されるp53蛋白発現と腫瘍Stageの間には相関は認められなかった。また、p53蛋白発現と腫瘍局在の間には相関は認められなかった。

　大腸癌においても大腸腺腫で認められたものと同様の"p48"が発現していた。しかし、この"p48"は大腸癌では、pAb1801ばかりでなくpAb421、pAb240が捕えたp53蛋白中にも存在していた。一部のGroup Bの腫瘍では、本来の分子量53kDを持つ"p53"が存在せず、48kDまたはそれ以下の分子量を示すp53蛋白のみが発現していた。大腸癌の原発巣とその肝転移巣は、同様の性質をもつp53蛋白を発現していた。

　ELISA、FCMの結果はそれぞれ、細胞質内、核内のp53蛋白発現量を反映していると考えられる。Group Aの腫瘍では、細胞質内、核内いずれにも同様にMutant p53蛋白の高レベルの発現がみられたが、Group Bの腫瘍では、核内p53蛋白発現量は細胞質内p53蛋白発現量に比べて少ない傾向が認められた。p53蛋白は、本来核内に存在するDNA結合蛋白であり、p53がその機能を発現するためには核内に存在することが必要である。すなわち、細胞質内に発現しているp53蛋白はその機能が不活性化された状態にある可能性がある。また、Group Bの一部の腫瘍は、ELISAでpAb421-/pAb1801+/pAb240-を示し、48kD以下の分子量を持つp53蛋白を発現していた。C末端を認識する抗体に反応せず、本来よりも小さい分子量を持つp53蛋白はC末端が切断されたp53蛋白である可能性が高く、C末端に存在するNuclear Localization Signalを失っているために、p53蛋白の核内への輸送が妨げられているものと考えられる。p53蛋白の局在は腫瘍によって異なり、それはp53の機能の相違を反映している可能性がある。また、p53遺伝子変異には様々な種類のものがあり、異なる変異を有するMutant p53蛋白は、異なる機能を持つことが知られている。Group AとGroup Bの間に見られるMutant p53蛋白の発現パターンの差は遺伝子の異なる部位のMutationを反映している可能性がある。

　大腸癌で認められた"p48"は大腸腺腫の"p48"と同様にC末端が切断されたp53蛋白であると考えられるが、大腸癌においては、"p48"は"p53"と結合して存在するために、"p53"とともにC末端を認識する抗体によって捕えられているものと推察される。大腸腺腫に発現しているWild-type p53由来の"p48"と、大腸癌に発現しているMutant p53由来の"p48"は異なる性質を持つものと考えられる。

　DNA indexは腫瘍DNAの全体的変異の程度を反映していると考えられ、一方、正常p53はDNAの安定性を保持し、その異常な増幅を抑制する働きがある。p53発現とDNA index上昇との強い相関は、p53がDNAの安定性を保持するうえで重要な役割を担っていることを示唆するものと考えられる。