分裂酵母Schizosaccharomyces pombe染色体遺伝子ライブラリーは野生株L972(h^-S)染色体DNAをSau3AIで部分分解し、BamHIで切断したpBluescript IIKS⁺ベクターへ挿入することによって作成されたものを用いた。S.pombe cDNAライブラリーはL972のpolyA⁺RNAからランダムプライミング法により合成したcDNAをpCDM8ベクターに挿入することによって作成した。

　res1⁺遺伝子欠損株(h^-S ade6-M216 ura4-D18 leu1-32 res1::ura4⁺)を0.5%グルコース、50mg/mlアデニン、ロイシンを含むEMM2培地中、30℃で対数増殖期になるまで増殖させ、S.pombe染色体遺伝子ライブラリーをリチウム法により導入した。30℃で16時間置いた後21℃で5-6日培養した。得られたコロニーから回収したプラスミドのうち再現性良くres1⁺遺伝子欠損株の表現型を相補し、かつres1⁺遺伝子DNAとハイブリダイズしないものを選んだ。 cDNAクローンは染色体遺伝子DNAをプローブとしてスクリーニングし、S.pombe cDNAライブラリーの中でプローブとハイブリダイズするものとして単離した。得られた染色体遺伝子およびcDNAは、断片をM13ベクターに組み込みdideoxy法で塩基配列を決定した。

　得られたres2⁺遺伝子の遺伝子破壊株を次のように作成した。res2⁺構造遺伝子の77%に当たる領域に相当するEcoT22I-PstI断片をura4⁺遺伝子に置き換え、その結果、ura4⁺遺伝子によって分断されたres2遺伝子断片を野生型細胞に導入しウラシル非要求性となった細胞からres2遺伝子破壊株を得た。遺伝子が目的どおりに破壊されていることはPCR法およびサザンブロット解析により確認した。

　res2⁺遺伝子破壊株とres1⁺遺伝子破壊株およびcdc10温度感受性株との二重変異株を作製し、その表現型を見るため四分子解析を行った。res1^-との二重変異株はres2⁺/res2^-res1⁺/res1^-のdiploid細胞を作製し、胞子形成させた後発芽させ、栄養マーカーを調べることによって二重変異株を同定した。cdc10^tsとの二重変異株はh⁺res2^-株とh^-cdc10^ts株とをかけ合わせることによって得た。

　res2⁺遺伝子は’start’遺伝子であるres1⁺の多コピーサプッレッサーとして得られたものであるが、同じく’start遺伝子’であるcdc10^ts変異株(cdc10-129)およびcdc10欠損株の表現型を相補するかどうかについて調べた。

　対数増殖期にある細胞(SSL+N培地)および窒素源を除いた培地(SSL-N培地)に移してから2,4,6,9,12時間経過した細胞からRNAを抽出しres2⁺遺伝子断片をプローブとしてノーザンブロット解析を行った。

　res2^-とpat1^tsとの二重変異株を作製し、温度を34℃にすることによって同調して減数分裂を起こさせ、減数分裂時のDNA合成におけるres2⁺の役割を調べた。温度シフトしてから経時的に細胞をとりflow cytometryによりDNA合成が起こっているかどうかを調べた。

　h⁹⁰res2^-を作製し、窒素源を枯渇させることにより減数分裂を誘導し減数分裂における役割を調べた。

　res1⁺遺伝子欠損株の低温感受性を相補する遺伝子をスクリーニングした。その結果4x10⁵個の中から98個の陽性クローンを得た。このうちres1⁺遺伝子断片とハイブリダイズしないクローンpG1-5について解析を行った。pG1-5はres1⁺遺伝子欠損株の低温感受性および高温感受性を相補した。

　pG1-5は3.4kbの染色体遺伝子をもっており、これとcDNAの構造解析からこの遺伝子は2つのエクソンをもち、657個のアミノ酸からなるタンパク質をコードすることがわかった。現在知られているタンパク質との相同性の検索の結果、この遺伝子がコードするタンパク質は、分裂酵母の’start’遺伝子であるcdc10⁺およびres1.⁺の遺伝子産物と相同性が認められた。このタンパク質はRes1により高い相同性を示したことから、この遺伝子をres2⁺と名づけた。Res2はCdc10およびRes1と同様に2つのアンキリンモチーフを持ちそのアミノ末端にはRes1と非常に相同性の高い領域を有していた。

　res2⁺遺伝子の機能を調べるためres2遺伝子破壊株を作製した。res2遺伝子破壊株は野生株に比べやや遅い増殖速度を示した。またres2とres1の二重破壊株を作製したところ、致死となった。このとき細胞は1回だけ分裂して死んでおり、細胞の形は典型的なcdc形質を示していた。これらのことからres2⁺遺伝子は有糸分裂の’start’においてres1⁺と重複した機能をもつことがわかった。さらにres2⁺はcdc10^tsを相補できるがcdc10破壊株をほとんど相補できなかった。cdc10^ts株との二重変異株を作製したがこれは許容温度下でも致死となった。

　h⁹⁰細胞およびdiploid細胞を窒素源枯渇下におくとres2⁺遺伝子が誘導された。この誘導はhaploid細胞ではみられず、res2⁺遺伝子が接合、減数分裂の過程で誘導されることがわかった。

　減数分裂におけるres2⁺の機能を調べるため、pat1^tsとの二重変異株を作製した。pat1^ts変異は34℃に温度をシフトさせると同調的にpremeiotic DNA合成を起こさせ、減数分裂に入らせるが、res2^-との二重変異株はpremeiotic DNA合成をすることができなかった。またh⁹⁰株においてres2^-細胞は減数分裂時にDNAの分配および胞子形成が異常になり、この異常はres1⁺によって相補されないことがわかった。