[緒言]ビタミンKは、1929年Damらにより血液凝固機転に重要な役割をもつものという意味で"Koagulation"の頭文字をとり命名された。当初は血液凝固因子の合成を促進する因子という考え方で研究されてきたが、1974年にプロトロンビン分子中に-カルポキシグルタミン酸(Gla)が発見されて以後、ビタミンKの作用機序が蛋白質のグルタミン酸(Glu)残基の位の炭酸置換を行なうY-カルボキシル化反応の補酵素として機能すると考えるようになった。ビタミンKと骨代謝との関連を示唆する報告は、すでに1960年からウサギにビタミンKを投与すると骨折治癒が早まること、ビタミンKの拮抗剤を服用した妊婦から出生した子供に骨発育不全が認められたこと、またビタミンKの拮抗剤を服用した患者で骨塩量の低下が認められたことなどがあった。骨で1975年HauschkaらがGla含有蛋白質としてosteocalcinを、1976年にはPriceらがMatrix-gla proteinを発見した。これらGla含有蛋白質が骨の石灰化部位に局在しており、Gla基はカルシウムイオンやヒドロキシアパタイトと親和性を有する事、osteocalcinは骨芽細胞が生合成、分泌する事などからビタミンKが骨代謝に重要な役割を果たしていると考えられるようになった。臨床面でも、骨折のある骨粗鬆症患者でビタミンK₁の血清レベルが低値であること、閉経前に比し閉経後女性で血清非カルボキシル化オステオカルシンが高値となり、高齢女性では有意に高くなることが報告され、1992年に折茂らが1(OH)₂D₃製剤との二重盲検試験においてビタミンK₂が退行期骨粗鬆患者の骨量を増加させるとの報告以後、ビタミンKの骨代謝における作用機序の解明に向けて研究が始められた。ビタミンKは卵巣摘除、ステロイド投与モデルラットにおいて骨強度および骨量を維持するとの報告、マウス頭蓋冠培養系で骨吸収を抑制する報告、ビタミンDで誘導された多核の破骨細胞様細胞数と吸収かがビタミンK₂で抑制された報告など多くの成績が骨吸収系について蓄積されてきてきた。これらからビタミンK₂による骨吸収系への作用は、破骨細胞の形成抑制を介しての作用であり、この破骨細胞形成抑制は破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化を直接抑制するのではなく、一部は骨芽細胞あるいは間質細胞の産生するPGE₂の抑制によることが示唆された。一方、骨形成系では培養ヒト骨芽細胞の石灰沈着をビタミンK₂が促進し、ビタミンDと併用すると石灰化およびオステオカルシン量が著しく増加するとの報告がある。しかしながら、ビタミンKの骨芽細胞における作用を、細胞生物学的に検討した報告は他にほとんどない。今回in vitroの骨芽細胞培養系を用いてビタミンK₂の作用機序の検討を行なった。

　本研究はビタミンKと骨代謝に関して臨床面や基礎実験において蓄積されつつある成績(骨量増加効果および骨吸収作用など)の背景となるメカニズムを探るため、in vitroの2種類の骨芽細胞培養系、すなわち、マウス骨芽細胞様細胞株(MC3T3-E1)とヒト骨肉種細胞(HOS-TE85)を用いて、ビタミンK₂(MK-4)の骨芽細胞に対する作用機序を細胞生物学的に検討し、下記の結果を得ている。

　1.MC3T3-E1とHOS-TE85を用いてMK-4のアルカリフォスファターゼ(ALP)活性と細胞増殖能に及ぼす影響の検討を行なった結果、MK-4は細胞増殖を抑制し、細胞内ALP活性を上昇させた。また、ビタミンKの拮抗剤であるwarfarinにて前処置し、ALP活性と細胞増殖能に及ぼす影響の検討を行なった結果、warfarinは両細胞株においてMK-4の細胞増殖抑制作用を抑制したが、MK-4の細胞内ALP活性上昇作用への有意な影響は認められなかった。これらの事から、細胞増殖にはMK-4がもつ-カルボキシラーゼの補酵素としての機能の関与が示唆された。一方、細胞内ALP活性におよぼす作用に関しては、-カルボキシレーション以外の作用が考えられた。

　2.MK-4の細胞増殖抑制作用および細胞内ALP活性上昇作用のメカニズムを探るためにthymidineとhydroxyureaでS期2重同調培養した細胞を用いて検討した。つまり、これらの細胞にBrdU(Bromodeoxyuridine)を取り込ませ免疫組織学的に検出し、DNA合成期にある細胞の割合を算定し細胞周期をモニターした。さらにMK-4で処理したHOS-TE85を用いて、FACS(fluorescence-activated cell sorter:propidium iodideとBrdUで2重標識)にて解析を行ない、MK-4の細胞周期に及ぼす影響を検討した。培養細胞を細胞周期のS期開始時期に同調させるとMK-4は細胞数倍化時間を延長させており、またBrdU染色でもMK-4は最初のS期への進行を遅延させ、細胞周期も延長させる事が示された。さらに、FACS解析でもMK-4はS期にある細胞比率を減少させていた事から、MK-4の細胞増殖抑制作用は、MK-4が最初のS期を延ばすこと及び細胞周期を延長させることで細胞分裂回数を減らすための結果と考えられた。細胞内ALP活性に関しては、ALP活性の高いstageの細胞(G1期)の細胞割合が増加するためと推測されたが、今回のS期2重同調培養法及びFACS解析の結果からでは結論づけられなかった。

　3.細胞内Ca²⁺は細胞増殖と細胞内情報伝達系においてsecond messengerの1つとされている。たとえば、マウス繊維芽細胞(Balb/c3T3細胞)などで、細胞内Ca²⁺の上昇が細胞増殖を促すと報告されている。そこで、MC3T3-E1において、MK-4の細胞内Ca²⁺へ及ぼす影響を検討した。その結果、MK-4は1,25-(OH)₂D₃と同程度に細胞内Ca²⁺を上昇させること及びこのMK-4による細胞内Ca²⁺の上昇の大部分はverapamil-sensitive calcium channelを介する細胞外からの流入であることが示された。また細胞内Ca²⁺はMK-4と1,25-(OH)₂D₃を同時に加えるとそれぞれの単独投与の時よりも上昇したことから、MK-4と1,25-(OH)₂D₃の共同作用の存在が示唆された。

　以上、本論文は骨芽細胞培養系において、MK-4が骨芽細胞の増殖を抑制しながら、分化誘導を促進するという新しい知見を明らかにした。MK-4の骨細胞への作用機序のメカニズムに関しては、骨吸収系については多くの基礎研究の報告がされてきているが、骨形成系についての基礎研究の報告はほとんどなく、本論文は細胞生物学的に骨形成系について検討した数少ない報告である。本研究は、今後老齢化社会の一層の進行と共に急増する骨粗鬆症の治療薬として期待される"ビタミンK"の作用機序のメカニズム解明に貢献しており、学位の授与に値するものと考えられる。