アクアライシンI生産のための発現プラスミドpAQNは、pUC由来の複製開始点oriとアンピシリン耐性遺伝子を含んでいる。T.aquaticus YT-1由来のアクアライシンI遺伝子の発現はtacプロモーター/オペレーター及びlacI^qの制御下にある。宿主にはE.coli TG1株[(lac-pro),supE,thi,hsdD5/F’traD36,proAB,lacI^q,lacZM15]を用いた。組換え体TG1(pAQN)を用い、まず発現誘導物質isopropyl -D-thiogalactopyranoside(IPTG)の添加時期及び濃度のアクアライシンI生産に及ぼす影響について検討した。生産量は誘導時の増殖活性と関係があり、対数増殖期の誘導が最も効果的であったが、IPTG0.2mM以上の添加を行っても顕著な増加は見られなかった(図1)。また逐次流加培養において、増殖阻害物質として知られる酢酸の蓄積が観察され、その阻害効果は濃度と密接に関係していた。この酢酸はアクアライシンI生産に対しても強い影響を及ぼし、単位菌体当たりの生産量,Y_P/Xは4〜8g/lの酢酸添加で無添加の場合の62%にまで低下した。

図1.アクアライシンI生産に及ぼすIPTG添加時期及び濃度の影響.記号:〇,初発添加;●,対数増殖期;□,直線増殖期;◇,遷移期;▽,静止期.

　酢酸蓄積による阻害効果を避けるため、オンライングルコースアナライザーとHPLCユニットによるオンラインモニタリングシステムを構築し(図2)、培地中の酢酸濃度をモニターしながらグルコースの供給速度を変化させる流加培養を行った。酢酸は培養中を通して1g/l以下に保たれ、培養14時間目において菌体濃度が18g/lに達したとき、33.2kU/mlのアクアライシンIが生産された。ここで、アクアライシンI活性は単位時間当たりのカゼイン分解活性であり、280nmにおける吸光度を1分間に0.002上昇させる活性を1Uと定義した。

図2.オンラインモニタリング装置.

　染色体上のlacUV5プロモーターの制御下に発現するファージT7RNAポリメラーゼ遺伝子を持つ大腸菌JM109(DE3)株(endA1,recA1,gyrA96,thi,hsdR17,(r_k^-,m_k⁺),relA1,supE44,(lac-proAB),[F’,traD36,proAB,lacI^q,lacZM15],(DE3))(F’⁺株)と、F’エピソームが欠落した大腸菌JM109(DE3)株(F’^-株)を宿主として用いた。T7プロモーターとアンピシリン耐性遺伝子を含む発現ベクターpGEMEX-2のT7 gene 10の下流にシグナル配列を持たないアクアライシンI遺伝子ならびにC末端プロ領域に欠失を持つ変異遺伝子を挿入し、pkAQN,pkAQNC30,pkAQNC105を作成した(図3)。pkAQNを導入した組換え体F’⁺株を培養しIPTGによる誘導を行ったところ、菌体破砕・遠心分離後の不溶性画分にT7 gene 10タンパク質(26kDa)とアクアライシンI前駆体(48kDa)から成る74kDaのタンパク質の発現が観察された。これは熱処理(75℃,2h)によってもプロセシングされず、生産されたアクアライシンIは活性化されない封入体を形成したものと考えられた。これに対しpkAQNを導入したF’^-株を培養した所、IPTG無添加でも約11kU/mlの可溶性アクアライシンIを生産した。この時、アクアライシンIは菌体破砕後の可溶性画分に総活性の80%以上が存在し、膜画分には総活性のわずか2%しか存在しなかった。IPTGの添加効果について検討した結果、ごく低濃度のIPTG(0.0125mM)添加により、無添加の場合の約2.5倍の可溶性アクアライシンIを得た(図4)。高効率発現系として知られるT7プロモーター発現系では、目的生産物はほとんどの場合封入体を形成することが報告されている。ここではlacI^q遺伝子をもつF’エピソームを欠落させlacリプレッサーの量を減少させることで、leakyな発現を誘導し、封入体の生成を回避できたものと考えられる。

図3.発現プラスミドpkAQN,pkAQNC30,pkAQNC105の構築.略語:N-pro,N末端プロ配列;C-pro,C末端プロ配列.C30,C105は前駆体のC末端側からそれぞれ30ならびに105アミノ酸残基が欠失していることを示す.いずれの遺伝子も野生型アクアライシンI遺伝子が持つシグナル配列のコーディング領域を欠失している.

図4.アクアライシンI生産に及ぼすIPTGの添加効果.記号:,IPTG添加後5時間目;,11時間目.

　次にF’^-株に3種の発現ベクター,pkAQN,pkAQNC30,そしてpkAQNC105(図3)をそれぞれ導入し、アクアライシンI生産に及ぼすC末端プロ配列の影響を検討した(図5)。組換え体F’^-株(pkAQNC105)は成熟酵素と同様のタンパク質(28kDa)を生産するためか、培養前半菌体増殖が著しく抑制された。またアクアライシンIはC末端プロ配列の欠損の有無に拘わらずIPTG無添加で生産され、中でも組換え体F’^-株(pkAQNC30)は培養12時間目に約36kU/mlの可溶性アクアライシンIを生産した。

図5.アクアライシンI生産における3種の組換え体の比較.宿主はF’^-JM109(DE3)株.記号:○,pkAQN;□,pkAQNC30;,pkAQNC105.

　高濃度培養時の酢酸による阻害効果回避のため、炭素源の効果について検討した所、グリセロールはアクアライシンI生産,最終菌体濃度ともに良好で(Y_P/X＝8.50×10³kU/g cell)、また酢酸生成もグルコースのそれと比較し1/2以下であった。しかし、資化速度が他のどの炭素源よりも低く、増殖の遅れも観察された。この欠点を補い、利点を生かすため、グルコースとグリセロールを用いる2段階流加培養を行った。酢酸は培養を通して3.2g/l以下に保たれ、菌体濃度が19g/l以上になったとき、152kU/mlの活性アクアライシンIが生産された。

　さらに組換え体F’^-株(pkAQNC30)を用い、実生産プロセスを念頭に回分培養において培地成分の検討を行った結果、トリプトンと酵母エキスを4倍濃度に高めたLB培地(4LB培地)を使用することにより、高濃度のアクアライシンIが得られた。4LB培地を用い、かつ酢酸の生成を抑制するため、グルコースとグリセロールを初発に添加する2炭素源回分培養を行った。グルコースがまず消費され続いてグリセロールが消費される2段階培養を行った時と同様の現象が観察され、この時酢酸は比較的低レベル(5g/l以下)で推移した。菌体濃度が22g/lに達した時、約200kU/mlのアクアライシンIが生産された(図6)。

図6.F’^-JM109(DE3)のpkAQNC30組換え体の2炭素源培養によるアクアライシンIの生産.記号:○,菌体濃度;●,アクアライシンI生産量;■,グルコース;□,グリセロール;,酢酸.

　以上、発現誘導条件を始め,オンラインモニタリングシステムの開発,発現プロモーターの変更,2炭素源を用いた流加培養法,また実生産プロセスを考慮した回分培養における培地成分の効果など,培養工学的検討を行うことにより、アクアライシンIを安定にかつ大量に生産することを可能にした。