センチニクバエの抗菌蛋白質であるsarcotoxin Iまたはsapecinの機能発現に重要なアミノ酸残基または領域を推定するための直接的な一つの手法は、これら抗菌タンパク質を遺伝子工学的に発現させる系を確立し、人為的に変異を導入したミュータント蛋白質を作成し解析することである。そこで、まず、すでに単離されていたsarcotoxin IAのcDNAを用いて、組換え型sarcotoxin IAの産生についで検討した。sarcotoxin IAは、バクテリアに対し強い殺菌活性を持つ蛋白質であるため真核細胞の発現系を利用することにした。その結果、カイコ卵巣由来細胞Bombyx mori BM-N cellを宿主とするバキュロウイルスベクター系を利用することで、組換え型sarcotoxin IAを初めて産生させることに成功した。しかしながら、センチニクバエの体液中で見いだされるsarcotoxin IAのカルボキシル末端(C末端)は-Arg-NH₂であるのに対して、この系で発現された組換え型sarcotoxin IAのC末端は-Arg-Glyであり、C末端のグリシン残基がアミド化されていなかった。また、この発現系では、組換え型sarcotoxin IAは、プロテアーゼで分解を受けることから、活性のある組換え型sarcotoxin IAを得るためには、システインプロテアーゼ阻害剤を添加する必要があった。本生産系は、sarcotoxin IAのC末端をアミド化する能力を持たないこと、また、プロテアーゼによる分解活性が強いことから、さらに、各種ミュータントsarcotoxin IAを作成するのには必ずしも適しているとは言えなかった。

　一方、センチニクバエの胚由来細胞であるNIH-sape-4は、培養上清中にsarcotoxin類や主にグラム陽性菌に対して抗菌活性を持つsapecinを生産し、抗菌タンパク質の生産系としても優れている。この生産系の検討中に、構造上sapecinに類似し、主としてグラム陽性菌に抗菌活性を示す新規な抗菌タンパク質sapecin B,Cを見いだした。SDS-PAGE上でシングルバンドにまで精製した後、Sapecin B,Cのアミノ酸配列とジスルフィド結合の位置を解析した所、sapecin Cは、sapecinと比較して40個のアミノ酸残基中31個のアミノ酸配列が同一であり、かつ、ジスルフィド結合の位置も同じことから、sapecinファミリーに属すると考えられた。

　一方、sapecin Bのアミノ酸配列は、図1に示すように、sapecinだけでなくカルシウム依存性K⁺チャンネル阻害剤として知られているサソリ毒の一種charybdotoxinとも高いホモロジーを持っていることが分かった。

図1 Sapecin Bとcharybdotoxinのアミノ酸配列の比較両蛋白質のアミノ酸配列には最大のホモロジーが得られるようにギャップを挿入した。同一のアミノ酸はボックスで囲み、ジスルフィド結合に与っているシステイン残基を直線で結んだ。

　Charybdotoxinの立体構造は詳細に調べられており、分子内にジスルフィド結合で連結された-ヘリックス構造と-シート構造を持つという特徴的な構造を持っていることが分かっていた。したがって、sapecin Bも同様な立体構造を持っている可能性が高いと考えられた。そこで、この特徴的なcharybdotoxinの立体構造から類推して、sapecin Bの-ヘリックス部分と-シート部分を保存するような形で分割し、各分解フラグメントの抗菌活性を調べれば、sapecin Bの抗菌活性のコア部分が決定出来るのではないかと考えた。図2に示すようにsapecin Bを4分割し対応するペプチドを化学合成し、グラム陽性菌のStaphyrococcus aureusを指示菌としてそれぞれの抗菌活性を検定した。その結果、-ヘリックス構造を持つと予想された部分である7R-17K fragmentだけに有意な抗菌活性が認められ、その活性の強さは、sapecin Bの約50%に相当していた。また、非常に興味深いことに、sapecin Bがグラム陽性菌にだけ強い抗菌活性を有しているのに対して、このペプチドは、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌ばかりでなく酵母など真菌類にも抗菌活性を有していることが明かとなった。次に、このペプチドの作用点を推定する目的でリン脂質に対する作用性を検討したところ、酸性リン脂質に結合する能力を有していることが分かった。さらに、バクテリアの細胞膜を模倣したリポソームに対する障害性を有していたことから、このペプチドの作用点はsapecin Bと同じく細胞膜であると予想された。これらの結果から、この7R-17k fragment部分がsapecin Bの抗菌活性のコア部分であると考えられた。

図2 Sapecin Bの分割と対応する合成ペプチドSapecin Bを4つに分割し、対応する部分のペプチドのカルボキシル末端をアミド化した形で化学合成した。7R-17K fragmentは-ヘリックス領域、29V-34Q fragmentは-シート領域に相当する。29V-34Q fragmentのカルボキシル末端のGlnはアミド化していない。

　7R-l7K fragmentは、11個のアミノ酸から成るショートペプチドであるから、ある程度立体構造の影響を除外して、アミノ酸配列と抗菌活性の相関を考察することが可能であると考えた。そこで、このペプチドのアミノ酸配列を改変したアナログを合成し抗菌活性を検討した。その結果、N-末端の塩基性アミノ酸の増加や疎水性アミノ酸の導入によって著しく抗菌活性が増強されることを見いだし、最も活性の高いアナログでは、抗菌活性をsapecin Bの約7.5倍に向上させることに成功した。また、これらアナログは、強い界面活性能を持ち界面活性能の強さと抗菌活性の強さの間には正の相関があることを見いだした。しかし、これらペプチドは、酸性リン脂質を含むリポソームを障害する作用を持つにもかかわらず、羊赤血球に対しては顕著な溶血活性を持たなかった。したがって、これら一連の抗菌ペプチドは、親蛋白質sapecin Bの選択毒性の一部を受け継いでおり、抗菌活性の発現において何らかの特異性を持つものと考えられた。

　以上、本研究において、センチニクバエの抗菌タンパク質の抗菌活性のコア部分と考えられる配列を初めて決定することに成功し、さらに、アミノ酸配列を改変することで抗菌活性を大幅に向上させることができた。今後、この活性コア部分の細胞膜中での立体構造や、リン脂質、細胞膜蛋白質との相互作用を検討することによって、抗菌活性発現のメカニズムや選択毒性の理解が深まると期待している。したがって、本研究を通じて得られたsapecin Bの活性コア部分は、新しい抗菌剤のデザインにおける有用なリード化合物となると同時に、抗菌タンパク質の研究において新しい局面を開くきっかけになるものと考えている。さらに、このコア部分は、抗菌活性ばかりでなくK⁺チャンネル阻害剤の研究においても有効なプローブとなる可能性を秘めていると考えられ、この方面での今後の進展にも期待したい。