窒素化合物は動物体内で分解されてアンモニアや尿素・尿酸となり、更に硝化細菌によって代謝されて硝酸や亜硝酸や一酸化窒素のような無機窒素化合物になる。最終産物はN₂であるが、NO₂を放出する生物も存在する。これらを産生する細菌を脱窒素細菌と呼ぶ。この細菌は無酸素状態で生育し、発酵の際に酸素分子のかわりに硝酸が最終電子受容体となって還元されてエネルギーを産生し、細菌の生命を維持している。この硝酸還元の過程はNO₃^-を出発物質として、(1)硝酸レダクターゼ(反応産物はNO₂^-)、(2)亜硝酸レダクターゼ(NO)、(3)酸化窒素レダクターゼ(N₂O)、(4)亜酸化窒素レダクターゼ、という4種類の酵素が順次作用してN₂を生ずる。第2段階の亜硝酸レダクターゼは亜硝酸を還元して一酸化窒素にする酵素であるが、シトクロームcd₁酵素、銅酵素、ヘキサヘムC型シトクロームという3種類のものが知られている。第3の酵素は亜硝酸を還元してアンモニアを産生するので、前2者とは異なっている。

　本研究はこの亜硝酸レダクターゼのうち銅酵素を精製し、シトクローム酵素との関係、ことに電子供与体としての特性を調べたものである。Achromobacter cycloclastesには亜硝酸レダクターゼよりも低分子で銅を含んだタンパク質である"青銅タンパク質(blue copper protein)"が含まれているが、このタンパク質が亜硝酸レダクターゼに電子を供給していて、この細菌のシトクロームは亜硝酸レダクターゼは電子供与体にならないことを明らかにすることが本研究の目的である。

　(1)使用細菌及び粗抽出液の調製:Achromobacter cycloclastes IAM1013を無酸素状態で培養し、Tis-HCl(pH7.6)を加えてホモゲナイズし遠心して沈さを除き粗抽出液を得た。

　(2)銅の含量の測定:Plasma Emission Spectroscopyで測定した。

　(3)酵素活性の測定:亜硝酸レダクターゼの活性測定はIwasaki,Matsubara法で行った。

　(4)EPR spectroscopy:EPR spectroscopyはVarian Model E-9 Spectroscopyを用いた。

　(5)stopped-flow experiment:Union Giken RA601 Rapid Reaction Analyzerを用い、無酸素溶液中で行った。

　Achromobacter cycloclastesの青銅タンパク質はplastocyaninと似ているがazurinとは異なっている。しかしながらazurinとシトクロームの関係と類似し、亜硝酸の還元において電子供給体となることができる。Achromobacter cycloclastesとAlicaligenes faecalis S-6の青銅タンパク質及び亜硝酸レダクターゼのアミノ酸組成およびN-末端アミノ酸配列は良く似ている。

　我々が精製したAchromobacter cycloclastesの亜硝酸レダクターゼは可視部の吸収波長、各タンパク質分子中の銅の含量、精製度、比活性はIwasaki,Mastsubaraらの報告とは異なっていた。また、Iwasaki,MatsubaraらはシトクロームC551、C553及びC550等が亜硝酸レダクターゼの電子供給体となることができると報告しているが、我々の分析では青銅タンパク質のみが亜硝酸レダクターゼの電子供給体となることができた。同じ細菌から分離したシトクロームC551、C554はいずれも電子供給体・電子受容体となることができなかった。従って、この細菌では青銅タンパク質が亜硝酸レダクターゼの生理的な唯一の電子供給体である。この生理機能は今後脱窒素反応との関連性について更に研究する必要がある。

　EPRの解析から、青銅タンパク質が1個のI型Cu²⁺を含んでいることが示され、その酸化還元電位は+308mVであった。一方、亜硝酸レダクターゼはI型とII型のCu²⁺を含んでいた。このタンパク質は青銅タンパク質を還元できることを明らかにした。

　また、これらの間の反応機序が明らかなったが、これはMicharski及びNicolasらの亜硝酸レダクターゼについての報告とは相容れないものである。彼らはII型Cu²⁺が電子供給体であると考え、また亜硝酸はI型Cu²⁺に付着していると考えた。Stopped-flow解析によると、sodium dithioniteで還元した青銅タンパク質が亜硝酸レダクターゼに遭遇すると2段階の反応が起こる。第1段階は亜硝酸と関係なく、青銅タンパク質を加えた後、直ちにburst kineticsとして観察された。このrate constantは(1.6±0.2)S^-1であった。第2段階のrate constantは(9.0±1.0)x10^-2S^-1であり、第1段階のrate constantの20分の1であった。亜硝酸をこの反応系に加えた時、還元型の青銅タンパク質の酸化作用はsecond-order kineticsであり、これのrate constantは(9.7±0.7)x10⁵M^-1S^-1であった。

　吸光度及びEPRの研究により、我々は脱窒素過程中の酵素に関する解析を行うことができ、酵素自体の様々な特性及び他の酵素に関する生理機能を明らかにすることができた。Stopped-flowの研究により、2つ異なるタンパク質の間の作用、反応速度及び効率に対する解釈がはっきりとしてきた。また、亜硝酸がこの2つのタンパク質の間の反応に促進効果があることが示された。