Lipid-modified Rab3Aとlipid-unmodified Rab3Aは、Rab3AをoverexpressionしたSpodoptera frugiperda cells(Sf9細胞)と大腸菌からそれぞれ精製した。c-Ki-RasとRhoA、Rap1Bは、それぞれの蛋白質をoverexpressionしたSf9細胞からそれぞれ精製した。Rab11は、Rab11をoverexpressionした大腸菌から精製した。Rab GDIは、ウシ大脳より精製した。シナプス小胞は、ラット大脳より精製した。

　GTPS結合型のlipid-unmodified Rab3Aを¹²⁵I-Bolton-Hunter試薬にて標識し、disuccinimidyl suberate(DSS)存在下で各サンプルと30℃、30分間インキュベーションさせ、SDS-PAGE後オートラジオグラフィーを行なった。

　Rabphilin-3Aと¹²⁵I-標識GTPS結合Rab3AのDSSによる化学架橋を、各種の非標識低分子量G蛋白質の共存下で行なった。

　Rabphilin-3Aの部分アミノ酸配列に相当するオリゴヌクレオチドプローブを用いてウシ大脳cDNAライブラリーをスクリーニングした。それにより得られたcDNAをシークエンスしてRabphilin-3Aの全アミノ酸配列を決定した。

　Rabphilin-3Aの部分アミノ酸配列に相当する18個のアミノ酸からなる合成ペプタイドをウサギに免疫し、得られた抗血清を抗原-アフィニティカラムにて精製した。

　GST(glutathione S-transferase)-Rabphilin-3Aは、Rabphilin-3AcDNAを組込んだ発現ベクターpGEX-2Tをトランスフォームさせた大腸菌より精製した。recombinant Rabphilin-3Aは、Rabphilin-3AcDNAを組込んだ発現ベクターpAcYM1をトランスフェクトしたバキュロウイルスを感染させたSf9細胞より精製した。

　ラットの各組織をSDS-PAGEして抗Rabphilin-3A抗体を用いてイムノブロットを行った。また、Rabphilin-3AcDNA全長をプローブとして、ラットの各組織についてノーザンブロットを行った。

　GST-Rabphilin-3Aを、GTPS結合型またはGDP結合型のlipid-unmodified Rab3A存在下でショ糖密度勾配遠心法にかけた。

　種々の濃度のNaClで処理したシナプス小胞を、超遠心にてシナプス小胞画分とNaCl可溶画分に分離した。次に、その得られたおのおのの分画をSDS-PAGEして抗Rabphilin-3A抗体と抗Rab3A抗体、抗synaptophysin抗体を用いてウエスタンブロットを行なった。

　シナプス小胞を1MNaClで処理し、ほとんどのRabphilin-3Aを可溶化してRabphilin-3Aを欠如したシナプス小胞を調製した。

　Rabphilin-3Aを欠如したシナプス小胞をGDPと反応させて内在性Rab3AをGDP結合型に変換後、RabGDIを作用させて内在性Rab3Aをシナプス小胞から引き抜いてRab3Aを欠如したシナプス小胞を調製した。

　Rabphilin-3Aを欠如したシナプス小胞にGTPS結合型のlipid-modified Rab3Aを内在性Rab3Aの約10倍量結合させてRab3Aを過剰量結合したシナプス小胞を調製した。

　種々の濃度のrecombinant Rabphilin-3Aと反応させたシナプス小胞をシュークロースベッド上に乗せて超遠心を行ない、シナプス小胞に結合したRabphilin-3Aと遊離のRabphilin-3Aを分離した。次に、シナプス小胞画分をSDS-PAGEして抗Rabphilin-3A抗体を用いてウエスタンブロットを行ないシナプス小胞に結合したRabphilin-3Aを定量した。

　Rabphilin-3Aを欠如したシナプス小胞をトリプシン処理し、処理後トリプシン阻害剤とプロテアーゼ阻害剤を加えて反応を停止した。反応停止後、トリプシン処理したシナプス小胞は残存トリプシンを除くために再度超遠心を行い調整した。

　種々の濃度のCa²⁺存在下で、NaCl処理によるRabphilin-3Aのシナプス小胞からの解離とrecombinant Rabphilin-3Aのシナプス小胞への結合を検討した。

　ウシ大脳膜コール酸可溶性画分と¹²⁵I-標識GTPS結合型Rab3AをDSSにて化学架橋させたところ、SDS-PAGE上分子量約110kDaのところに新たなバンドの出現を認めた。Rab3Aの分子量はSDS-PAGE上約24kDaであることから、Rabphilin-3Aの分子量はSDS-PAGE上約86kDaと考えられた。

　Rabphilin-3Aはウシ大脳膜コール酸可溶性画分よりQセファロースカラムクロマトグラフィー、モノQカラムクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ショ糖密度勾配遠心分離法を組み合わせて高度に精製した。さらに、そのアクティブフラクションをPVDF膜に転写後、Rabphilin-3Aに相当するバンドを切り出してRabphilin-3Aを精製した。

　Rabphilin-3AはSDS-PAGE上分子量約85kDaで、サブユニット構造をもたない単一のポリペプチドであった。Rabphilin-3Aは、翻訳後修飾に関係なくGTP結合型Rab3Aに結合してGDP結合型Rab3Aにはほとんど結合しなかった。また、c-Ki-RasとRhoA、Rap1B、Rab1lにはGTP結合型、GDP結合型ともに結合しなかった。

　Rabphilin-3Aは704個のアミノ酸から成り、大部分が親水性で膜貫通領域を有しなかった。アミノ酸組成から計算した分子量は77,976であった。また、Rabphilin-3Aは既知の蛋白質ではなく全く新しい蛋白質であった。さらに、Rabphilin-3Aには、CキナーゼやsynaptotagminのC₂領域と相同性の高い配列がC末端側に2回繰り返して存在していた。

　イムノブロットとノーザンブロットの結果から、Rabphilin-3Aはラット大脳にのみ存在していた。

　Rabphilin-3AはNaCl濃度依存性にシナプス小胞から解離し、1MNaClでほとんどのRabphilin-3Aはシナプス小胞から解離した。しかし、Rab3Aとsynaptophysinはシナプス小胞からは解離しなかった。

　Rabphilin-3Aを欠如したシナプス小胞へのrecombinant Rabphilin-3Aの結合は、Rabphilin-3A濃度依存性であり、飽和結合であった。half maximal bindingは50nMで、シナプス小胞1個当たり約5±1分子のRabphilin-3Aが結合した。しかし、recombinant Rabphilin-3Aは赤血球ゴースト膜には結合しなかった。また、このRabphilin-3Aのシナプス小胞への特異的結合はシナプス小胞をトリプシン処理することで消失した。

　recombinant Rabphilin-3Aは、Rab3Aを欠如したシナプス小胞やRab3Aを過剰量結合したシナプス小胞にも同様に結合した。その結合はRabphilin-3A濃度依存性であり、飽和結合であった。half maximal bindingは50nMで、シナプス小胞1個当たり約5±1分子のRabphilin-3Aが結合した。

　Ca²⁺存在下でも、NaCl処理によりRabphilin-3Aはシナプス小胞から解離した。しかし、約10%のRabphilin-3Aは2MNaCl処理でもシナプス小胞から解離しなかった。また、Rabphilin-3Aのシナプス小胞への特異的結合はCa²⁺によって影響を受けなかった。