神経芽腫は小児腫瘍の中では、白血病、脳腫瘍に次いで頻度が高く、かつ、至って予後が不良である。これまでの研究から、いくつかの予後判定因子が明らかにされているが、それらの中でがん遺伝子N-mycの増幅の有無が患者の予後と最も深い相関関係にあることが知られている。したがって、Southern hybridization法を用いて腫瘍組織中のN-myc oncogeneの増幅度を定量することは、患者の予後判定上きわめて重要である。しかしながら、Southern hybridization法は遺伝子の定量法としては優れているものの、比較的多量の腫瘍組織と時間、費用を要すること、あるいは手順が繁雑であること等の欠点をもっている。このためより微量の検体からN-myc遺伝子のコピー数を迅速かつ正確に測定する方法の開発が望まれてきた。

　そこで、より簡便で信頼性の高いN-myc増幅度定量法確立を目的として、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR法)に基づいた新たな定量法(競合的PCR法、competitive PCR)の開発を行なった。

　PCRはSaikiらによって開発されたin vitroでの遺伝子増幅法であり、少量の検体量ですみ、かつ短時間で結果が得られるという利便性があるが、定量性には乏しい。Becker-AndreとHahlbrockはPCRの長所を生かしたまま、定量性を持たせた競合的PCR法を考案した。競合的PCRの原理は、定量しようとする鋳型DNAと既知量の類似DNA(競合DNA)とを同一試験管に入れ、1種類のプライマーセットを用いて、増幅反応を行ない、産物DNAの量比から元の鋳型DNA、即ち、定量しようとする鋳型DNAの量を知ろうとする方法である。

　競合的PCR法は従来法であるSouthern hybridization法と比べて、試料が少量で済み、迅速であり、また、操作手順が少ないという利点があり、かつその原理に鑑みて正確度も高いと考えられる。現在のところ、まず、エチジウムブロマイド染色法により増幅の有無の判定をし、増幅の認められた検体については放射活性標識ヌクレオチドを用いた方法でより正確なコピー数を求めるという手順で行うのが最も合理的であると思われる。エチジウムブロマイド染色法による判定は、DNAの調製も含めて2日間で済み、また、ラジオアイソトーブを用いた最終判定までを行っても4日間で正確な増幅度が得られる。本法は、今後、針生検材料や内視鏡下生検術で得られる材料など、検体量が極めて限られた症例での応用が特に期待される。

　神経芽腫においてN-myc遺伝子の増幅度や発現の程度を知ることは、予後判定に重要な情報を与えてくれる。増幅度の測定には従來Southern hybridization法が用いられてきたが、近年、PCRの普及に伴い、PCR法に定量性を持たせる試みが多くの研究室で行われるようになった。N-myc遺伝子増幅度測定にPCR法を応用した例としては、differential PCRがあるが、この方法では大まかなコピー数しか求められない。

　以上の背景に基づき、今回、正確なコピー数を知るための競合的PCR法を確立した。本法は競合DNAの調製が必要であることやPCR産物量の数値化が要求されることなどその確立までに若干の煩雑さを伴うものの、その得られた値の信頼度は従来法(Southern hybridization法)と同様に比べきわめて高いと思われる。

　神経芽腫から摘出した47検体(腫瘍組織、ヌードマウス移植株、株化細胞)について得られたコピー数はSouthern hyhridization法による値とよく一致し、本法がSouthern hybridization法にかわる迅速、簡便なN-mycがん遺伝子増幅定量法として有用あることが示された。