血管平滑筋は、細胞膜上に存在する多くの種類の受容体やイオンチャネルにより細胞外刺激に対する多彩な制御を受けている。その収縮制御には、刺激に基づいた細胞内Caイオン濃度の増加とプロテインキナーゼの活性化が重要とされる。細胞内へのCa動員は、Caチャネルを介した細胞外からのCa流入と、筋小胞体(SR)からの細胞内Ca動員が主な機構として考えられている。細胞内Caイオンの増加は、Ca依存性酵素カルモジュリンの活性化およびプロテインキナーゼによるリン酸化ステップを経た後、Ca依存性の収縮反応を惹起する。一方、細胞膜リン脂質代謝産物によるプロテインキナーゼC(PKC)活性化反応も、細胞内Caイオン非依存性の収縮機構として重要視されている。冠動脈の攣縮発作など血管の異常収縮を一因とする疾患は、このような細胞内Ca濃度の持続的な異常増加およびプロテインキナーゼの持続的活性化に基づく病態と考えられ、これらの治療は死亡原因になりうる心疾患への進展を予防しうる重要なものである。 ところで近年、様々な血管作動性物質による受容体活性化以後のシグナルトランスダクションに基づいた細胞膜リン脂質代謝産物がCaイオノフォア様作用に基づいたCa膜透過の増加を引き起こすと報告されている。Caイオノフォアの血管収縮反応は非常に強力かつ持続的であり、Ca拮抗薬や受容体拮抗薬などの血管拡張薬にことごとく抵抗性を示す。すなわちこの反応を抑制することは、これまでの既存の薬物療法に抵抗性を示す病態治療に有用である可能性が考えられる。本研究を行う中で、私はKチャネル開口薬のクロマカリムの誘導体展開から新たに合成されたピラノベンズオキサジアゾール誘導体のNIP-121に、この血管収縮作用に対する強力な抑制作用があることを発見した。そこで、NIP-121を用いた新たな病態治療の可能性を追求するため、本薬物の血管弛緩作用機序を総合的に特徴付け、Caイオノフォア収縮抑制機序との関連について検討した。また、受容体結合実験によりその作用点についても検討した。  図1.NIP-121の化学構造(*は不斉炭素の位置を示す)1.NIP-121の血管弛緩作用機序に関する検討 NIP-121は、あらかじめ30mM KClまたは10-6MプロスタグランジンF2 で収縮させたラット大動脈を、いずれも10-4M papaverineで得られた最大弛緩反応の約85%以上濃度依存的に弛緩した。受容体アゴニスト収縮に対しても完全な弛緩作用を示すことから、Ca拮抗薬とは異なった機序であることが示唆された。一方、60mM KCl収縮に対しては、30mM KClの際観察されたNIP-121の弛緩作用が消失した。これもCa拮抗薬と全く異なる薬理特性であり、このような特徴は近年血管拡張薬として注目されているKチャネル開口薬、例えばクロマカリムやニコランジルの作用と非常に類似するものである。すなわち、外液K濃度が増加したためKの平衡電位に近づいてK流出作用が失われたものと考えられた。またNIP-121は86Rb+の細胞外流出を増加することが確認された。この86Rb+細胞外流出増加作用はATP感受性Kチャネル阻害薬のグリベンクラミドにより濃度依存的に抑制された。 Kチャネルの開口は、電位依存性Caチャネルの活性化域値よりも細胞膜電位を過分極側に下げる。そこでCa蛍光プローブのfura-2を負荷したラット大動脈により、NIP-121の細胞内Caイオン濃度に及ぼす影響を張力変化と同時に検討した。この際、2相のCa増加過程(細胞外からのCa流入とSRからのCa遊離)を分離して捉えることに成功し、血管平滑筋における細胞内Ca動員機構を詳細に検討することができた。その結果、NIP-121がSRからのCa動員に影響せずに、細胞外からのCaチャネルを介したCa流入だけを選択的に抑制することを示すことができた。この結果は、Ca除去液中におけるノルエピネフリンのphasic収縮相に対してNIP-121が影響しないという実験結果とも良く一致した。また、tonic収縮相に村するNIP-121の血管弛緩反応がほぼ完了した時点で細胞内Ca量はかなり残存していることが用らかとなった。このCa残存量に見合うだけのCa濃度を増加するだけのノルエピネフリンを適用した場合には有意な張力の増加を確認したことから、NIP-121は収縮蛋白質に対するCa感受性の低下作用を有する可能性が示唆された。さらに、NIP-121はホルボルエステルにより活性化されたPKCに基づくCa非依存性の収縮反応(PKC阻害薬のH-7で抑制)に対しては影響を及ぼさないことが明らかとなった。 以上の結果より、NIP-121が、細胞膜のグリベンクラミドに感受性を持つKチャネル(ATP)感受性Kチャネル)開口に基づいた細胞膜の過分極によって、外液Ca依存の持続的収縮相すなわちtonic収縮相を抑制することを明らかにできたものと考える。また、Ca感受性低下作用も血管弛緩作用機序の一因として考えられた。さらに、SR由来のCa増加およびプロテインカイネースC活性には影響を及ぼさないことが明らかとなった。 2.NIP-121のCaイオノフォア収縮に及ぼす影響 本研究では、血管平滑筋細胞内Ca増加に基づく血管収縮反応惹起のためにCaイオノフォアのA23187を用い、NIP-121の作用を内皮を傷害したラット胸部大動脈により検討した。 その結果、NIP-121が30mM KClあるいは受容体アゴニスト惹起の血管収縮抑制作用を示すのと同等の濃度で、A23187惹起血管収縮反応を抑制することを初めて明らかにした。この作用はNIP-121と同じ作用機序を有すると考えられるクロマカリムおよびニコランジルでも同様に観察された。また、この作用は、Kチャネル開口薬として特徴的な薬理特性(高濃度K存在下で弛緩反応が消失)を反映していることが明らかになった。一方、この作用はCa拮抗薬のニフェジピンではほとんど抑制されないことが確認された。さらに、A23187存在下Ca除去液中におけるCa収縮(ニフェジピン抵抗性)の大部分をNIP-121が抑制することが明らかとなり、この抑制作用は外液からのCa流入抑制によっていることが示唆された。 以上の結果より、NIP-121によるA23187による収縮反応の抑制作用が、Kチャネル開口に基づく細胞外からのCa流入阻害作用によっていることを初めて明らかにしたと考える。また、このCa流入経路は、Caイオノフォアにより独自に形成される細胞膜のCaポアと考えられ、生理学的にも非常に興味深い作用であると考える。さらに、前に述べたCa感受性低下作用が関与する可能性も考えられた。 3.NIP-121の血管作用に対するATP感受性Kチャネル阻害薬グリベンクラミドの影響とその作用点の検討 摘出血管におけるNIP-121の作用は、ATP感受性Kチャネル阻害薬のグリベンクラミドにより濃度依存的に拮抗された。その拮抗様式をSchild解析により解析した場合、Schildプロットの傾きが約1に回帰される競合的拮抗作用であり、グリベンクラミドはNIP-121の競合的拮抗薬であると解釈された。しかしながら、これまでこれらの関係を受容体結合実験により直接証明した実験はなく、NIP-121の特異的結合部位とグリベンクラミドの特異的結合部位の関係についての詳細は未解明であった。そこで、[3H]グリベンクラミドの特異的結合に対するKチャネル開口薬のNIP-121およびレプクロマカリムの影響について検討した。 まず、ラット脳および心室筋ミクロソーム標品において[3H]グリベンクラミドとNIP-121あるいはレブクロマカリムを同時に20分間インキュベートした。その結果、NIP-121およびレブクロマカリムともに[3H]グリベンクラミド特異的結合を阻害せず、摘出血管による実験結果とは異なる解釈を導くこととなった。その原因を調べるため、あらかじめNIP-121あるいはレブクロマカリムと脳ミクロソーム標品を60分間プレインキュベートした後に、[3H]グリベンクラミドを添加して更に20分間の飽和実験を行い結合動態の変化を観察した。その結果、Kチャネル開口薬を前処置したミクロソーム標品においては、濃度依存的に解離定数(Kd値)および最大結合量(Bmax値)が影響を受けることを初めて見出した。これら2つの実験結果の差異は、NIP-121あるいはレブクロマカリムの受容体結合が平衡状態に到達するまでの時間がグリベンクラミドよりも遅いことに起因する可能性が考えられた。また、脳の[3H]グリベンクラミド結合部位が1種類であること、Bmax値の低下が最大約30%に留まる完全なものではないことから、Kチャネル開口薬の結合が[3H]グリベンクラミドの結合をnegative allostericに調節している可能性が示唆された。この結果は、グリベンクラミドの結合がKチャネル開口薬の結合をnegative allostericに調節しているとする従来の報告とは別に、両受容体間の関連をKチャネル開口薬の受容体側から初めて示したものであり、見かけ上の競合的拮抗作用を説明する上で非常に意味深いものと考える。また、NIP-121とレブクロマカリムの結合実験におけるBmax値低下作用の活性比は血管弛緩作用の比とほぼ一致し、薬理学的に意味のある濃度域でこの様な現象が引き起こされていることが示唆された。 総括 新規に合成されたピラノベンズオキサジアゾール誘導体NIP-121の血管における薬理特性について検討した結果、以下の結論を得た。 1)NIP-121は、Kチャネル開口薬としての薬理特性、すなわちKの細胞外流出促進作用を示すことが明らかとなった。その作用は、クロマカリムに比べ約10倍強力であった。 2)NIP-121が、Ca拮抗薬に抵抗性を示す受容体アゴニストのみならず、Caイオノフォアによる血管収縮反応に対しても強力な抑制作用を示すことを初めて明らかにした。この作用は、Kチャネル開口作用に基づく過分極が細胞外からのCa流入経路を抑制した結果引き起こされたと考えられた。また、血管平滑筋細胞内の収縮蛋白質に対するCa感受性低下も関与する可能性が示唆された。一方、受容体アゴニスト惹起のtonic収縮相を完全に抑制する濃度域においてphasic収縮相は抑制しないことが明らかとなり、SRからのCa遊離に基づく血管収縮には影響しないことが示唆された。 3)NIP-121の作用は、ATP感受性Kチャネル阻害薬のスルフォニルウレア誘導体グリベンクラミドにより競合的に拮抗された。しかしながら、スルフォニルウレアの特異的結合部位に直接結合せず独自の受容体を有することが示唆され、相互の結合部位間でnegative allostericに互いの結合量を調節して、見かけ上の競合的拮抗作用を示している可能性が示唆された。 以上の結果より、ピラノベンズオキサジアゾール誘導体NIP-121の血管弛緩作用機序を明らかにすることができたと考える。また、今回新たに発見したCaイオノフォアの血管収縮反応に対するNIP-121の抑制作用が、Kチャネル活性化作用に基づいていることを明らかにすることができ、過分極-収縮連関に新たな概念を加えることができたと考える。このことから、NIP-121が他の血管拡張薬に抵抗性を示す血管収縮病変に対しても有効である可能性を示唆できたものと考える。 |