消化管粘膜は、細胞更新のきわめて速い組織である。上皮細胞はたえず増殖分裂を操り返し、数日内に管腔側にはげ落ち更新されている。胃粘膜でも腸粘膜でも細胞増殖は粘膜の特定の部位に存在する増殖細胞(幹細胞)から増殖・分化する。幹細胞は常に増殖を繰り返し様々な細胞に分化する。消化管の細胞は増殖しながら分化する動的で独特な細胞であるといえる。この上皮細胞の増殖・分化には多くの増殖因子がオートクリン・パラクリン因子として関与していることが明らかになってきた。一般に消化管上皮細胞の増殖にはTGF-,EGF,HGFなどが、間質細胞の増殖にはbFGF,TGF-,EGFなどが関与することが知られている。これらの増殖因子は潰瘍性病変などの粘膜欠損の修復過程で重要な役割を果たしていることが明らかになってきた。これら増殖因子の作用や作用機序を明らかにすることは潰瘍性病変などの病態生理の理解、さらには治療法の確立において重要であると考えられる。

　トコレチネート(TR)はレチノイン酸とトコフェロールをエステル結合して得られた化合物である。この新規化合物は線維芽細胞などの細胞系で増殖促進作用を示し、また血管新生促進作用など多彩な薬理活性をもつことが知られている。実際ラット実験消化性潰瘍でその修復を促進することが確認されている。TRは経口的に投与されると消化管でまったく分解・吸収されずに便中にそのままの形で回収される。このことはTRが小腸、あるいは大腸の粘膜へそのままの形で到達することを意味している。従ってもし小腸や大腸の粘膜の上皮細胞に対して増殖促進作用をもつならば、胃潰瘍治癒促進効果と同様に、クローン病や潰瘍性大腸炎などの大腸粘膜病変の治癒促進や瘻孔の閉鎖促進にも有効である可能性が考えられる。そこで本研究では培養小腸上皮細胞を用い、細胞増殖におけるTRの作用を検討すると共に、その作用機序についても検討を行った。

2結果

　まずFH細胞の増殖を促進する因子について検討した。静止期FH細胞を10%FCSを含むDME培地で培養するとDNA合成は無血清培地の場合に比べて約10倍増加した。EGF,IGF-IはDNA合成をそれぞれ3倍、2倍に増加させた。EGFとIGF-Iを同時に加えると10%FCSに匹敵する効果を示した(図1)。

　次に増殖因子の作用にたいするTRの効果を検討した。図2はEGFの作用に対するTRの効果を示したものである。EGF単独の効果はわずかであるがTRを含んだ培地で予め培養し、その後EGFを加えるとDNA合成は飛躍的に増加する。図3はEGF1nM存在下でのTRの作用の濃度依存性を示したものである。その作用はTR10^-9Mから認められ、10^-7Mで最大効果を示した。

　TRがどのような機序でEGFの作用を増強するかを検討した。その結果TR前処理により培養上清中にEGF作用を増強する因子が放出されていることが判明した。EGFの作用を増強するものとして図1に示すようにIGF-Iがある。そこでTRがはたしてIGF-Iの産生を促進するかをみるために、培養上清中のIGF-IをRIAで測定した。

図1:FCS,EGF,IGF-IのFH細胞に対するDNA合成促進効果。

　図4に示すようにTRは濃度依存性にIGF-Iの産生・放出を促進した。その濃度依存性は図3に示すEGF作用の増強の濃度依存性とほぼ一致した。IGF-Iの作用を確認するため、抗IGF-I抗体がTRの作用にあたえる影響を検討した。その結果抗IGF-I抗体はTRの作用を大きく減弱した。またTRで処理したFH細胞でRT-PCRを行い、IGF-IのmRNAの発現が確認された。

図表図2:静止期細胞を10^-8Mトコレチネートを含む(●)、あるいは含まない(○)無血清培地で24時間培養し、その後各濃度のEGFを加えDNA合成を測定した。 / 図3:静止期細胞を各種濃度のトコレチネートを含む無血清培地で24時間培養し、その後1nMのEGFを加えDNA合成を測定した。(○)はコントロールとしてトコレチネート前処理なし、EGFなしの条件。図4:静止期細胞を各種濃度のトコレチネートを含む無血清培地で24時間培養し、培養上清中のIGF-I活性を測定した。

　本研究は新規合成化合物であるトコレチネート(TR)の様々な薬理作用の一つである細胞増殖促進作用の作用機序を解明する目的で、ヒト胎児小腸上皮細胞であるFHs74Int細胞(FH細胞)を用いて、そのDNA合成および細胞増殖に影響を与えるかについて検討を行い、さらにその作用機序について解析を試みたものであり、以下の結果を得ている。

　1.FH細胞は接触抑制がかかり、confluent monolayer cultureが得られ、上皮成長因子(EGF)、インスリン様成長因子(IGF-I)が増殖を刺激する。FH細胞をTRを含んだ培地で予め培養しておくと、EGFのDNA合成促進効果はさらに増強された。またFH細胞をTRを含んだ培地で予め培養した培養上清には、DNA合成を促進する因子が含まれていた。

　2.この培養上清中のIGF-IをRIAで測定したところ、TRの濃度に依存してIGF-Iの活性が見いだされた。IGF-Iの特異性は抗IGF-I抗体でその作用が打ち消されたことにより確認された。以上よりTRはFH細胞のIGF-I産生を刺激し、培養上清中にIGF-Iを放出し、FH細胞のDNA合成を促進するものと考えられた。

　3.RT-PCRによりTRで処理したFH細胞にIGF-ImRNAの発現が確認された。TRで処理されていないFH細胞ではIGF-ImRNAの発現が確認されず、TRが実際にIGF-ImRNAの発現を促進していることが確認された。

　以上、本論文はTRがヒト胎児小腸上皮細胞であるFHs74Int細胞の増殖を促進することを明らかにした。TRは特にEGFの作用を大きく増強した。その理由としてTRがEGFの作用に相乗的に働くIGF-Iのオートクリン産生を促進するためであることを分子生物学的手法を用いて明らかにした。TRがどのようにしてIGF-Iのオートクリン産生を促進するかは今後の課題である。TRは熱傷・褥瘡の治癒促進効果が認められており、実験消化性潰瘍の治癒促進効果が確認され、臨床的応用が検討されているが、その作用機序は不明な点が多い。今回明らかになったin vivoでのユニークな作用機序は、in vitroでも起こる可能性があり、創傷治癒の機序を探る一つの手がかりとして、また消化管病変への製剤の開発にも結びつくものと思われ、学位の授与に値するものと考えられる。