U1-C3’部分を規定するcDNA,PS2を用いてヒト繊維芽細胞及び包皮上皮細胞から作成されたpCDプラスミドライブラリからU1-C全長を規定するクローンFS2をクローニングした。FS2は大腸菌にて全長U1-C蛋白を発現していることが確認された。FS2の3’末端から削った削除変異株M1-M9及びエピトープ領域だけを規定するエピトープ発現株を作成し、これらの変異株が産生するリコンビナント蛋白を患者血清にて免疫染色すると、どの患者血清でもM1とM3の間で大きく抗原性が変化しこのU1-C蛋白の102-125アミノ酸の領域に主要な抗原性決定領域が存在することが示唆された(PCRC領域)。またこの大きな変化以外にも患者血清により異なるエピトープが存在することが示唆された。PCRC領域は抗U1-C抗体陽性血清全例で独立した強い抗原性をもつことが確認され、さらにPCRCはFS2と同じかそれ以上に抗U1-C抗体活性を吸収したので、このPCRC領域が主要エピトープであることが確認された。この主要エピトープPCRC領域は三つに分けて発現させてもそれぞれが独立した抗原性をもつのでエピトープの巣状の集合であると結論した。コンピューターを用いて主要エピトープ領域のアミノ酸配列の外来抗原との相同性の解析を行った結果、単純ヘルペスウィルスI型ICP4蛋白との6アミノ酸の相同性が判明した。U1-C、単純ヘルペスウィルスI型ICP4蛋白それぞれの相同部位を含む合成ペプチド(CE1P,HSVP)また大腸菌にて発現させた融合蛋白(HSVEX)は、ELISAにて検討すると抗nRNP抗体陽性患者血清で認識された。さらにCE1Pへの反応性はHSVPでHSVPへの反応性はCE1Pで互いに阻害された。従ってU1-Cと単純ヘルペスウィルスICP4蛋白相同部位には交差反応性が存在する。CNBr活性化セファロース4Bビーズ固相化リコンビナントPCRCで患者血清より精製した抗U1-C抗体はU1-Cに加えU1-A,B/B’蛋白をも認識した。U1-C蛋白とU1-A、Sm-B/B’蛋白との交差反応性はU1-Cの主要エピトープ領域を介していると結論づけられた。

　U1-Cには、抗体陽性患者血清全例で認識される主要な抗原性決定領域と患者血清によって反応性が異なる幾つかのエピトープが存在し、さらにこの主要エピトープ領域もエピトープの巣状の集合体である。このようなエピトープ存在様式は自己抗原が免疫原として患者免疫系を刺激しているという仮説によく合致する。またこの主要エピトープ領域には二つの交差反応性があり一つは単純ヘルペスウィルスI型ICP4蛋白と、もう一つはU1-A蛋白、Sm-B/B’蛋白との交差反応性である。ヘルペスウィルスの持続感染があると個体ごとに異なる免疫反応のなかでさまざまな抗体が出現してくるがその中に抗ICP4(a4)抗体も出現しうる。この抗ICP4(4)抗体を認識するB細胞が交差反応するU1-C蛋白をとりこみ、自己反応性T細胞を活性化することによってU1-C抗原に対する免疫寛容が破られる。一度U1-C抗原に対して免疫寛容が破られると今度はU1-C抗原と他の自己抗原の交差反応によりU1-AやSm-B/B’抗原も免疫系に認識されていくという道筋が考えられる。実際抗Sm抗体陽性患者血清は殆ど抗nRNP抗体陽性であり、抗nRNP抗体から抗Sm抗体へと進展するのではないかと考えられている。

　抗56K抗体陽性患者血清を用いてヒト奇形腫より作成したgt11発現ライブラリーより単離された陽性クローンは56K蛋白全長を規定していることが明らかになった。なぜなら1)このcDNAのin vitro翻訳物は、SDS-PAGE上でおおよそ56Kであった。2)この生成物はいずれの抗56K抗体でも免疫沈降できた。3)このクローンをpET8cに組み込み大腸菌にて発現させたリコンビナント蛋白を用いて精製した抗体はHeLa細胞抽出物中の56K蛋白を認識したからである。このcDNAクローンは、1992塩基で最長読み枠は1515塩基で505のアミノ酸を規定しこの予測生成物の分子量は約543%Kで、目的の分子量に非常に近い。この56KcDNAをコンピューター検索するとウシのCa依存性リン脂質結合蛋白アネキシンXIと極めて相同性が高いことが判明した。即ちアネキシンメンバー間でかなり異なるアミノ末端側でも非常に類似しており全体のアミノ酸レヴェルで92.5%の相同で、56KはヒトアネキシンXIと同定された。

　HEp-2単層培養細胞と免疫ウサギ及び患者血清より固相化56K/アネキシンXIで精製した抗56K/アネキシンXI抗体を用いて蛍光抗体法を行ったところ細胞質、核どちらも染色された。以上よりヒト56K/アネキシンXIは細胞内に広く分布する分子であることが判明した。C末端側からの削除変異株5つを選び出しin vitroで転写、翻訳したものを抗56K抗体陽性患者血清を用いて免疫沈降したところ、抗56K/アネキシンXI自己抗体のB細胞エピトープの発現にはN末端より123アミノ酸が必須であり、もしこのエピトープが短いポリペプチドからなる連続性エピトープにちかいものであるならば32番から70番の間にある可能性が強く、アネキシン間でよく保存されているC末端ではなくアネキシンXI特異的なN末端に対する反応であることが判明した。抗56K/アネキシンXI抗体の疾患における分布をELISAで検討したところ慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、全身性硬化症、シェーグレン症候群で6.7-10.1%の陽性率であった。従って抗56K/アネキシンXI抗体はRAやSLEに特徴的とはいえずさまざまな全身性自己免疫疾患で出現するが正常人や慢性に経過するウィルス感染症患者血清などでは稀で抗56K/アネキシンXI抗体の出現は全身性自己免疫疾患に限られている可能性が強い。 抗56K/アネキシンXI抗体の疾患特異的で診断的価値の確立されている他の代表的自己抗体との力価とアイソタイプを比較するために、同様の方法で発現精製した代表的リコンビナント自己抗原Ro60,トポイソメラーゼI,CENP-B,アネキシンXIに対する抗体価をELISAで検討した。抗56K/アネキシンXI抗体はこれらの疾患特異的抗体と同じかそれ以上の力価のIgG型抗体が産生されていることが判明した。

　アネキシンXIはヒトと前後してウシ、ウサギでそれぞれ別々の観点からクローニングされた興味深い分子であり、Ca依存性リン脂質結合蛋白のファミリーを形成しているユニークなアネキシン蛋白群に属する。アネキシンが果たして生体内でどのような役割をはたしているかについては未だに一定の見解はない。

　ウシアネキシンXIには選択的スプライシングにより生じるA,B二つのアイソフォームがあり、全体の長さは2アミノ酸しか違わないが、N末端より21から60アミノ酸の部分が異なる。ウシではタイプAが優位で今回クローニングしたヒトアネキシンXIはこのタイプAのホモログと考えられる。互いの異なる部分はウサギアネキシンXIではカルサイクリンとの結合部分でありさらに抗56K/アネキシンXI抗体の認識エピトープともかさ重なっているので、抗56K/アネキシンXI抗体はタイプAのみを認識するのか、ヒトアネキシンXIもカルサイクリンと結合しているのかなどの問題が提起されるであろう。

　抗56K自己抗体は他のアネキシンとは交差反応せず、RA,SLEに限らず自己免疫疾患全体で広く8-10%出現するものの、他の代表的自己抗体と同じく高親和性高力価のIgG型の抗体である。従ってアネキシンXIに対する特異的免疫応答もこれらの自己免疫疾患でおきている可能性が強い。この抗56K抗体が出現する意義については、アネキシンに対する自己抗体が炎症を鎮める働きのあるリポコルチンの作用を阻害することが炎症の増悪に意味があるのではないかという説、アネキシンファミリーはリン脂質結合蛋白であり抗凝固作用をもつことから抗リン脂質抗体症候群との関連などが考えられる。アネキシンVが₂グリコプロテインIと同じく抗リン脂質抗体のコファクターとして注目されている。アネキシンXIが抗リン脂質抗体のコファクターである可能性を検討したが、予備的な実験では否定的であった。今後アネキシンXIの本当の細胞内機能の追求と併せてなされるべき課題であろう。