高等動物はその生涯を通じて、神経系・免疫系・内分泌系が相互に干渉し合って、恒常性維持を行っている。サイトカインと呼ばれる一群の生理活性蛋白質は、本来免疫系から発見されたものであるが、これら各系の中か、或いは相互の間の情報伝達分子群となっている。また、それらの産生と生理活性のクロストークは多種の生体応答を誘導し、生体恒常性維持に寄与しているものと考えられる。

　腫瘍壊死因子(TNF)は組織化されたサイトカインネットワークを統括すると考えられている分子である。これは、何らかの一次刺激により、リポ多糖(LPS)等に対する感受性が高まる段階(primed stage)と、実際にLPS等による二次刺激によりTNFが分泌される段階(triggered stage)との二つの活性化状態を経て、主にマクロファージ()から効率良く産生される。このうちprimed stageへの活性化は、健常時の個体においても観察され、この状態が生体恒常性維持に関与する事を示唆する報告もある。この場合、分泌型のTNFの存在がみられないが、それと同様な生物活性を示す膜結合型前駆体(proTNF)として作用している可能性が考えられる。

　しかし現在まで、primed stageでの膜結合型proTNFの存在についての分子レベルでの証明、及びproTNFの生物活性の意義を生体制御機構の問題として捉えた研究は、十分ではなかった。そこで本研究では、まず二段階の活性化状態を通じたTNF分子の産生過程を詳細に調べると共に、サイトカイン産生調節を通じた生体制御機構への関与のモデルとして、膜結合型proTNFが、自身の産生調節に与る役割を明らかにする事を目的とした。

　本論文は、膜結合型TNF前駆体を産生する細胞が、細胞間接触を介して、隣接細胞におけるTNF産生能を正負両様に制御する事を示し、膜結合型TNFが、その一般機能の二面性を通じて、生体恒常性維持に関与する可能性を示唆した報告である。

　本研究の予備段階で、Oldらによる原報通りに個体レベルでpriming刺激を与えた実験動物から、primed を取り出し、TNFの存在状態を調べたところ、成熟TNFの分泌を伴わないproTNFの産生が認められた。この状態変化に伴うTNFの産生状態を分子レベルで更に詳細に検討する為、以下の実験は、ヒトの様の培養細胞であるTHP-1を用いた。本細胞におけるprimed stageは、インターフェロン(IFN)-,TNF-,或いはフォルボールエステル(PMA)で誘導したが、その測定には、誘導後に加えるLPS刺激(triggered stage)によって生ずる、成熟TNF分泌の増加量を指標とした(Fig.1)。

Fig.1 Kinetics of TNF accumulation in the culture supernatant during the triggered stage.THP-1 cells were treated with rIFN-(10³U/ml),rTNF-(10³ U/ml),or PMA(100ng/ml)for 24h.After extensive washing and resuspending,cells were challenged with 1g/ml of LPS for indicated periods of time.TNF amount in the culture supernatants was measured by radioimmunoassay system.Each value is the mean of duplicate assays.ND means"not detected"(less than 0.15ng/ml).(○)primed with rIFN-;(●)primed with rTNF-;(■)primed with PMA;(△)without priming.

　何れのprimerによっても、刺激後一過的にproTNF mRNAの発現が誘導され、膜結合型proTNFが産生された(Fig.2)。また、このprimed stageを経たTHP-1は、triggered stageでのproTNFの再生産量が増加する為、成熟TNFの分泌が一層増加するものと考えられた。即ち、primed及びtriggered stageの二段階の活性化過程で、proTNFが二相性に発現する事が明らかになった。

Fig.2 Detection of 26-kDa TNF precursor on the cell-surface of primed THP-1 cells.THP-1 cells were treated for 3h with or without various primers.Cell-surface labelling with Na¹²⁵I was carried out using lactoperoxidase and glucose oxidase.After the labelling,cells were extensively washed,lysed,and subjected to immunoprecipitation analysis.Immunoprecipitated materials were subjected to SDS-PAGE followed by autoradiography.Following reagents were used to stimulate THP-1 cells:LPS(10g/ml);rIFN-(10³ U/ml);rTNF-(10³ U/ml);PMA(100ng/ml).

　第2章で示した様に、primed stageにおいてはその誘導剤の種類に関わらず一過的にproTNFが産生される。本章ではprimed stageで産生されるproTNFの意義を検討した。

　前述の様にTHP-1は、IFN-によりprimed stageにまで誘導される。この際産生されるproTNFの機能を、抗TNF抗体により阻害すると、LPS刺激後の成熟TNFの産生量はprimed stageを誘導されていない細胞によるものと同程度に留まった(Fig.3)。成熟TNFはそれ自身で、のTNF産生のprimerになり得るが、ここに得られた事実は、primed stageでのproTNFの存在自身こそが、LPS刺激に対するTHP-1の感受性増強に、関与している事を示すものと考えられる。

Fig.3 Suppression of priming activity of rIFN- by the presence of anti-TNF- monoclonal antibody at the primed stage.THP-1 cells were treated with rIFN-(10³ U/ml)for 24 h with or without anti-hu-rTNF- monoclonal antibody F5H12(10 g/ml).A control experiment was run parallel using non-specific mouse IgG(10 g/ml). After extensive washing and resuspending,cells were challenged with LPS(1g/ml)for 5 h.TNF amount in the culture supernatant was measured by radioimmunoassay.Each value is the mean of triplicate assays.

　ProTNFは成熟TNFに相当する部分を細胞外に露出している事から、細胞間接触を介して、隣接する細胞を連鎖反応的にprimed stageへと、誘導するものと考えられた。そこで実際に隣接した細胞間ではどうなるかを検討した。ProTNFを恒常的に発現する繊維芽細胞株(proTNF/3T3細胞)を人為的に作製し、これとTHP-1とを混合培養した。

　この場合はTHP-1のLPS依存性TNF産生能は、著しく低下した(Fig.4)。このLPSに対する低応答性は混合培養時に抗TNF抗体を加える事により正常に回復した事から、やはりproTNFにより誘導されたと考えられた。この事は、この混合培養の場合と先のprim ed THP-1自身がproTNFを産生する場合とでは、proTNFが異なる作用機序を介してTHP-1に働く可能性を示唆する。そこで、両方の場合について、介在するシグナル伝達機構の違いを検討した。

Fig.4 Suppression of LPS-dependent TNF prodection by THP-1 cells that was cocultivated with proTNF/3T3 cells.1.5×10⁶ cells each of pMT2/3T3 cells,human proTNF/3T3 cells,and proTNF/3T3 cells were seeded onto gelatin coated plastic dishes(60)and were incubated to allow to form a confluent monolayer.5×10⁶ cells of THP-1 cells were seeded at the density of 1×10⁶ cells/ml onto monolayer of various 3T3 transfectants.IFN- primed THP-1 or unprimed THP-1 was prepared simultaneously as the controls.After 24 hours,THP-1 cells were washed and challenged with LPS.Five hours after the addition of LPS(0.1 g/ml),culture supernatants were subjected to radioimmunoassay for secreted mature TNF.

　IFN-等による、THP-1のprimed stageの誘導は、C-キナーゼ(PKC)の特異的阻害剤であるH7により抑制されたのに対して、proTNF/3T3細胞との接触により誘導されるTHP-1のLPS応答性の低下は、H7添加により解除されなかった(Fig.5)。TNFの遺伝子発現は、PKC活性化を通じて制御される事が既に報告されているが、この結果からTNF産生のポジティブフィードバック機構に、proTNFの作用がPKC活性化を伴って関与する一方、proTNF/3T3細胞との混合培養の場合は、PKC活性化が直接関与せず、寧ろ逆にTHP-1がLPS刺激に際して新たにTNFを産生する能力を低下させる働き、即ちネガティブフィードバック制御をするものと考えられる。

Fig.5 Differences in the signal transduction pathway between exogenous cytokine-induced hyper-respensive state and proTNF-induced hypo-responsive state of THP-1 cells against LPS.THP-1 cells were pretreated with either IFN-(10³ U/ml)or various 3T3 transfectant in the presence or absence of 50M H7.After 24 h,cells were washed and challenged with LPS(0.1 g/ml)for 5h.TNF amount in the culture supernatant was measured by radioimmunoassay.

　以上の結果から、proTNFの存在はTHP-1のprimingには必要条件の一つではあるものの、寧ろその生物活性の発現は標的細胞側でのシグナル伝達の違いに依存して、TNFの発現制御にPKCの活性化が介入する場合は正、そうでない場合は負と、正負両様に自己再生産調節に関与するものと考えられる。

　以上本研究では、proTNFが標的細胞に対して、たとえ同一種の細胞であっても、介在するシグナル伝達経路の違いに応じて、自己再生産能を正負に制御し得る事を明らかにした。この事は、恒常性維持に関わると考えられる因子の機能が、状況に応じて正負両方向に揺らぐ可能性を分子レベルで示唆し、生体恒常性維持機構の分子基盤の理解に、新しい視点を与えたものと考える。