[³H]-標識したPS-コレステロールリポソームでリポソームブロッテイング法を行ない、ラット脳でPS-BPの存在について検討した。膜画分(P₂,P₃画分)を可溶化後、DEAE-セファロースFast Flow、オクチルーセファロースCL-4B、TSKヘパリン-5PW、TSKG3000SWを用いた数段のクロマトグラフィー操作ででPS-BPを精製した。

　精製したPS-BPをリジルエンドペプチダーゼで消化し、消化断片のアミノ酸配列を決定した。決定した部分アミノ酸配列の情報を基にラット脳のcDNAライブラリーからPS-BPに相当するクローンをスクリーニングしその推定アミノ酸配列を決定した。

　リン脂質-タンパク質結合定量法(定量法1と定量法2)で検討した。定量法1では固相化リン脂質に対するタンパク質の最大結合量をタンパク質の抗体を用いて定量した。定量法2では固相化タンパク質に対するリン脂質を含んだリポソームの結合を[³H]-標識したリポソームを用いてシンチレーションシステムで定量した。

　ラット脳の細胞質画分からPKCsを調整し、タンパク質をリン酸化した。リン酸化タンパク質のPSへの結合をリン脂質-タンパク質結合定量法に従い定量した。

　得られたcDNAクローンを大腸菌発現用ベクターpET-8cまたはpGEX-2Tにクローニングし、大腸菌株BL21(DE3)pLysSで発現させた。pGEX-2Tを用いて発現させたグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質はグルタチオンーセファロース4Bカラムを用いて精製した。

　欠失(deletion)変異及び点変異タンパク質をsite-directed mutagenesisに従い作製し、GSTとの融合タンパク質として大腸菌で発現させ、精製後PSとの結合を定量した。

　リポソームブロッテイング法を用いてラット脳からカルシウム非依存性PS結合タンパク質(PS-BP 70)を同定した。精製したタンパク質をリジルエンドペプチダーゼで消化し、D(A)E(F)EPAPGATADDAPSAAGPEQEAPAXXD-;DEAAAAAGGDAAAAPGEQAGXAXAEXAXGG-.を含むいくつかの部分アミノ酸配列を決定した。この情報を基ににcDNAクローニングを行なった。遺伝子配列を決定したクローンの推定アミノ酸配列は得られた部分アミノ酸配列全てを含み、PS-BP70はラットのMARCKS(myristoylated alanine-rich C kinase substrate)である事が明らかとなった。

　リン脂質-タンパク質結合定量法を用いてMARCKSのリン脂質への結合について検討した。MARCKSは特異的にPSに結合し、ホスファチジルコリン等他のリン脂質への結合は認められなかった。

　MARCKSをPKCでリン酸化し、MARCKSのPSへの結合を定量した。リン酸化されたMARCKSは結合が著明に減少していた。

　大腸菌でMARCKSは可溶性タンパク質として発現した。GST融合タンパク質として大腸菌で発現させたMARCKS(GST-MARCKS)もラット脳から精製したMARCKSと同様、特異的にPSに結合した。更にGST-MARCKSの欠失変異体を発現させ、PS結合領域について解析した。GST-MARCKS_6-180とGST-MARCKS_127-160は全長のMARCKSとほぼ同様のPS結合性を有していたが、GST-MARCKS_127-152のPS結合性は著明に減少していた。GST-MARCKS_6-156はGST-MARCKS_6-180の62%がPSに結合したのに対し、GST-MARCKS_6-152はわずか8%、GST-MARCKS_6-135にいたっては結合が認められなかった。これらの結果からアミノ酸残基127-156の領域そのものがPS結合性を有し、アミノ酸残基153-156(FKKS)が特に大きく関わっている事が明らかとなった。

　MARCKSのPKCによるリン酸化部位はSer-152、-156、-163である事が知られている。PKCによるリン酸化の影響についてリン酸化部位のセリンをアラニンに変えた変異体を作成し検討した。PKCでリン酸化されたGST-MARCKS_6-180[S156A,S163A]、GST-MARCKS_6-180[S156A]及びGST-MARCKS_6-180[S163A]のPS結合性は、PKCでリン酸化されたラット脳のMARCKSやGST-MARCKS_6-180のそれとほぼ同レベルであった。一方、GST-MARCKS_6-180[S152A]とGST-MARCKS_6-180[S152A,S156A]はPKCでリン酸化を受けてもPS結合性を保持していた。