生デンプンなど難分解性多糖類の分解酵素を生産分泌する微生物を自然界より分離することを試み、生デンプンプレート上で大きなハローを形成する新規酵母を一株取得した。本酵母は生デンプンだけでなく、キシラン及びペクチンを唯一の炭素源とする培地においてもよく生育できることより、生デンプン、ヘミセルロース(キシラン)及びペクチン分解酵素など多様な難分解性多糖類分解酵素を生産分泌しているものと思われた。

　本菌の形態は、球形から楕円形で、多極出芽による増殖を示し、真性菌糸や仮性菌糸の形成は認められなかった。また、化学的生理的性質より、担子菌系不完全酵母のCryptococcus属に属する酵母であると同定され、本菌をCryptococcus sp.S-2(以下CS-2)と称することとした。

CS-2菌の生産する-アミラーゼについて

　CS-2株は生デンプン分解力をもつ酵素を分泌生産することが予想され、酵母の生産する新規な生デンプン分解酵素として興味が持たれた。その精製アミラーゼは分子量約66,000であり、アミロースの分解パターンより、-アミラーゼであることが示された。また、豚膵臓-アミラーゼに匹敵する強い生デンプン分解力を持ち、同時に生デンプンに対する吸着性を有していた。また、高い温度安定性を有していた。

　CS-2-アミラーゼ(以下AMY-CS2)をコードする遺伝子の解析より、成熟蛋白は611アミノ酸よりなることが示された。そのN末端より496残基までの部分はAspergillus oryzaeの-アミラーゼ(タカアミラーゼ)の全領域と高い相同性(49.7%)が見られ、また酵母Saccharomycopsis fibligera及びSchwanniomyces occidentalisの-アミラーゼともそれぞれ47.4%、48.2%の相同性が見られた。

　一方、タカアミラーゼ相同部位以降にはAspergillus nigerのグルコアミラーゼIのC末端領域と相同性の高い部位が存在した。AMY-CS2のこのC末端側部位を欠失した変異アミラーゼは、生デンプン吸着力及び分解力の消失が観察され、AMY-CS2のC末端部位は、生デンプン吸着性及び分解性に関与していることが確認された。

　CS-2株が生産分泌するキシラン分解酵素を精製した。分子量は22,000、等電点は7.4であり、キシランの分解様式よりエンド型キシラナーゼであることが示された。本CS-2キシラナーゼ(以下XYN-CS2)は、反応最適pHが2という、酸性領域で強い活性をもつ特徴的な性質を有していた。現在キシラナーゼは様々な起源のものが数多く知られているが、XYN-CS2のような強い酸性領域で活性をもつキシラナーゼはAspergillus kawachii由来のキシラナーゼCの報告があるだけで、酵素化学的にも、また実用的にも興味深いものであった。

　XYN-CS2をコードする遺伝子の解析より、XYN-CS2は209アミノ酸よりなり、その推定アミノ酸配列はAspergillus kawachii、Bacillus pumilus、B.subtilis、Clostridium acetobutylicum、Streptomyces lividans、Trichoderma reeseiなどのファミリーGグループに分類されるキシラナーゼと高い相同性が認められた。このことよりXYN-CS2も同ファミリーに属すると考えられる。

　このグループのキシラナーゼはアミノ酸残基の保存性が高く、どれも同じような分子構造をしているだろうと言われている。このようなファミリーGキシラナーゼにあって、酸性領域で強い活性を持つXYN-CS2とA.kawachiiのキシラナーゼCの活性部中央付近に、他には見られない特異な2つのシステイン残基が存在し、これら残基が、XYN-CS2が酸性領域で強い活性を持つ機構に関与している可能性を示唆した。

CS-2 -アミラーゼ、キシラナーゼの生産誘導条件

　CS-2株はS.cerevisiaeなどと違って、様々な糖を資化する能力をもち、これらの糖が-アミラーゼ、キシラナーゼ生産の誘導抑制にどのような効果を持つのか興味がもたれた。さらにその制御がどのような仕組みで行われているかを知る手がかりとするために、両プロモーター配列の比較を行った。

　両酵素とも、培地pH5と7で菌体の増殖はほぼ同等であるのに関わらず、pH5での生産性は高く、pH7で低い生産性を示し、これら酵素生産が培地pHに大きく依存することを示した。

　キシラナーゼ生産に関しては、本来生産抑制的に働くD-キシロースが、CS-2株においては生産を抑制することなく誘導的に作用する特異な現象を示した。

　-アミラーゼプロモーターにはA.nidulansおよびS.cerevisiaeのカタボライト・リプレッションのリプレッサー蛋白であるCREAおよびMIG1が標的とし付着するとされている配列が4カ所存在し、グルコースをはじめとした多くの糖によりカタボライト・リプレッションを受ける現象を裏付けた。

　一方、Aspergillus tubigensisのキシラナーゼプロモーターなどに同じく存在しているCREAの標的となる配列が、XYN-CS2プロモーターにおいては見当たらなかった。

　両プロモーター部位に共通に存在する配列を比較検討したところ、A、B、C、D、E、Fの6つの相同性の高い配列が見い出された。

　さて、本酵母はグルコアミラーゼの生産が認められないことより、デンプン中での増殖性や分解利用効率があまり良くない。また、25℃以下を好む低温性の酵母であるため、発熱をともなう排水処理槽での定着性もよくないことが予想され、本菌を直接排水処理に使用することは難しそうである。しかし一方、本菌の生産分泌する難分解性多糖類分解酵素は、食品工業排水を処理する上で極めて魅力ある酵素群であると判断される。それゆえ、今回クローニングした酵素遺伝子を、新たな排水処理システムを開発していく際の有用な供与遺伝子資源として把握し、排水処理用酵母として現在実用されている酵母を宿主として、それに新しい能力を付加するための有力な道具として役立てることを今後検討してゆきたい。

　焼酎蒸留排水の効果的な微生物処理方法の開発を目指し、芋焼酎蒸留排水を効果的に固液分離させる微生物を自然界より幅広く検索した結果、排水中の固形分に強く吸着しそれらを凝集させる性質を有する微生物M111株を分離することができた。分類学的検討から、本菌はGeotrichum属に帰属する酵母であると同定された。

　M111株は、芋焼酎蒸留排水に10⁷個/ml程度添加し、軽く撹拌するだけで直ちに排水固形物を凝集させる効果を持つ。その凝集物は、Fig.2の右側のように、ガーゼ様の濾布で容易に濾別することができ、芋焼酎蒸留排水中の繊維質の固形物のほとんどが凝集塊として簡単に分離された。このことより、今まで有効な固液分離の処理法がなく、その多くを海洋へ投棄することで処分されてきた焼酎蒸留排水の処理に本菌が利用できる可能性が示された。

Fig.2.Filtration of the residue of sweet-potato shochu distilation with M111 cells(about 10⁷ cells/ml)(right),or without them(left)

　芋焼酎蒸留排水固形物に対する凝集促進性は、本菌が蒸留排水固形物に強く吸着し、菌体が架橋物として固形物同士を結合させることによることが観察された。

　本菌は芋焼酎蒸留排水の固形物だけでなく、アビセル(微結晶セルロース)セルロースパウダー、濾紙セルロース、パルプ排水、トマトジュース固形物などセルロース系固形物一般に対して、強い凝集促進性を示した。

　各種凝集阻害試験において、芋焼酎蒸留排水固形物とセルロース系固形物が全く同じパターンを示したことより、本菌の芋焼酎蒸留排水固形物への吸着凝集性は、排水固形物成分のセルロース繊維に対する吸着に由来することが推察された。

　また、本菌とセルロース系固形物との凝集には、SDSの存在および菌体のプロテアーゼ処理により凝集性が失われることより、菌体表層にあるタンパク質が関与している可能性が示唆された。なお、どのようなタンパク質が関与しているかについては、今後検討していきたい。

　本菌はプラントレベルでの処理試験においても芋焼酎蒸留排水の固液分離に著しい効果のあることがわかり、焼酎蒸留排水の固液分離処理に実用可能であることが示された。

　以上