5’-イノシン酸、5’-グアニル酸を化学調味料の原料として、工業的規模で製造する試みは旧くから行なわれ、現在では、プリンヌクレオチドの生産量は国内で約5000トンに及び、わが国の発酵工業の一翼を担っている。 製造法としては当初、酵母リボ核酸の酵素的分解による方法が主体であったが、現在では直接ヌクレオチドを発酵により製造する方法、または、ヌクレオシドを発酵で得てこれをリン酸化させる方法が主流となってきた。筆者らは後者の方法が経済的にもっとも有利であると考えて研究を実施し、従来にない新しい知見を得てこれらを応用することに成功した。 枯草菌において、プリンヌクレオチドはdenovo合成経路を経て合成され、これが脱燐酸化を受けて菌体外に排出される。野生株では、これらの合成系は厳密な代謝調節を受けているためにプリンヌクレオシドの蓄積は見られないが、今日における代謝制御発酵の技術により、菌体外にプリンヌクレオシドを著量に蓄積する変異株が育種され、実用化されている。しかし、コスト削減のために、菌株の一層の改良育種が望まれている。すなわち、従来より収率の高い菌株の育種、イノシン、グアノシンどちらかのみを著量に蓄積する菌株の育種、任意のイノシン/グアノシン生産比率に適応する菌株の育種が望まれる。

　本研究の目的は、伝統的な手法で育種されたイノシン・グアノシン生産菌をもとに、遺伝子組換え技術を用いて、これらの要望に応えるべく新しい育種法を確立することにある。

　グアノシン蓄積能を有するB.subtilis NA7821株の染色体DNAからIMPデヒドロゲナーゼ遺伝子を E.coli C600のキサンチン要求性株を宿主として、要求性相補からpBR322にクローン化した。挿入断片は6.4kbのPstI断片であった。つぎにこれを、HindIIIで部分分解し、pC194に連結し、B.subtilis Marburg MI114株のキサンチン要求性株にサブクローン化した。得られたプラスミドをイノシン・グアノシン併産株B.subtilis NA6128株に導入したところIMPデヒドロゲナーゼ活性は導入前に比較して約10倍上昇し、著量のグアノシンの蓄積が認められ、ベクターを用いた典型的な遺伝子導入効果が見られた。

　ベクターを用いる遺伝子導入の方法では、酵素活性の上昇は期待できるが、減少もしくは不活性は期待できない。特定の酵素を不活性化するには、酵素遺伝子をクローン化し、薬剤耐性遺伝子を挿入し、これを枯草菌に形質転換させ相同組換えを起こし薬剤耐性となった株を取得する方法がとられる。すなわち、クローン化されたIMPデヒドロゲナーゼ遺伝子に薬剤耐性遺伝子catが挿入されたDNAをE.coli内で構築し、これを用いて、イノシン・グアノシン併産株B.subtilis NA6128株を形質転換したところ、得られたクロラムフェニコール耐性株はすべてキサンチン要求性を示し、IMPデヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されていることが示された。それらの菌株のイノシンの生産はB.subtilis NA6128株のほぼ2倍に達した。Southernハイブリダイゼーションの解析結果についても形質転換株染色体上のIMPデヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されていることが示され、本方法は、極めて選択的な、かつ、確実な酵素活性欠損株取得法であることが判った。

　クローン化された6.4kbのguaBを含む挿入断片より、E.coli中でのキサンチン要求性相補を指標としてguaBの存在位置を調べた結果、guaB遺伝子はXba I-Hin cII断片(1.85Kb)上にあることがわかった。 そこで、Xba I-Hin cII断片の塩基配列の決定を行ったところ、この断片上に 513 アミノ酸をコードする1539bpのオーブンリーディングフレームが存在し、その間始コドンの上流にはGAAAAGAGGGGなる配列が見いだされ、guaBのSD配列と推定された。 またその上流には、枯草菌の-35領域のコンセンサスに一致するTTGACAが、さらに17bp離れてTAATCAなる配列が見いだされた。 このことから、これらが各々本遺伝子のプロモータの-35,-10領域であると推定した。塩基配列から推定されるアミノ酸配列を報告にある大腸菌のIMPデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と比較したところ、52%の相同性が認められ、また塩基配列から推定される枯草菌のIMPデヒドロゲナーゼの分子量は、Mr＝55,724(513A.A.,1,539bp)であり、Tiedemann and Smithが報告している大腸菌のものときわめて近い(Mr＝54,512(511AA,1,533bp))ものであった。

　染色体上のIMPデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を人為的に調節できれば、イノシン/グアノシン生産量比を安定させることを含め両者を任意の比率で生産させることが可能になることが期待される。前項と同じ相同組換えを利用する方法で染色体上のプロモーターが交換された株の育種を行った。 すなわち、クローン化されたIMPデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモータおよび構造遺伝子の大部分が欠失したDNAを作製し、これを用いて染色体上のguaBの大部分が欠失したキサンチン要求性形質転換株(guaB株)をイノシン・グアノシン併産株B.subtilis NA6128株より取得した。別途、guaBのプロモーター部分を枯草菌内で高発現が期待できるSP01プロモーター,低発現が期待できるP1プロモーターに各々置換したDNAを作製し、これらを用いて上述guaB株を形質転換した。 前者を用いて得られた形質転換株では、酵素活性の上昇とグアノシン蓄積量の増大が、また後者を用いて得られた形質転換株では、酵素活性の低下とイノシン蓄積量の増大が認められた。これは染色体に組み込まれた改変guaBの発現によるものと考えられた。

　枯草菌のプリンヌクレオチド生合成系酵素群は、プリンオペロン上にコードされていることが知られている。大腸菌のプリン要求性株を用いて要求性相補を指標にイノシン・グアノシン併産株B.subtilis NA6128株の原株であるB.subtilis No.115株のプリンオペロンをクローニングした。B.subtilis No.115株のプリンオペロンの構造およびプロモータ領域の塩基配列はEbbole and Zalkinによって報告されているB.subtilis 168株のものとよく一致した。 クローン化されたプリンオペロンDNAのプロモータ領域上流より種々の長さが欠失したDNAを作製し、これを用いてB.subtilis 168株を形質転換し、形質転換株のプリンオペロンの発現をアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を指標に解析した結果、転写開始点上流-84〜-61にアデニンによる抑制部位が、また、下流+1〜+200付近にグアニンによる抑制部位が存在していることが判った。これらの制御領域を欠失させ、高発現の期待できるSP01由来のプロモー夕を連結したDNAを作製し、これを用いてB.subtilis 168株を形質転換したところ、そのプリンオペロンの発現は、アデニンおよびグアニンの存在下においても抑制を受けず構成的に発現していることが認められた。上述のDNAを用いて、イノシン・グアノシン生産株B.subtilis NA6100株から得られた形質転換株はNA6100株に比して約1.5倍のイノシン・グアノシン生産を示した。一方、このDNAを用いてイノシン・グアノシン生産株B.subtilis NA6128株を形質転換したところ、生育不良とイノシン・グアノシン生産の低下が見られた。アデニンによる抑制部位を残しグアニンによる抑制部位を除いたDNAによって形質転換されたB.subtilis NA6128株の形質転換株は、正常な生育と約2割のイノシン・グアノシン生産の増加が認められた。高生産株の育種にはグアニンによる抑制部位を欠失させることが有効であった。

　イノシン、グアノシンの生産比率を任意に変え、これに適応する菌株の育種、およびプリンヌクレオチド合成系を強化した菌株の育種を目的として、プリンヌクレオチド生合成関連酵素遺伝子の発現制御に的を絞り育種を展開し、伝統的育種技術に組換えDNA技法を組み合わせた。その結果、ほぼ意図した目的を達成することができた。本手法により、変異点を目的遺伝子に限定する事ができ、再現性よい結果が得られることが明らかになった。また、単に生産性の高い優良株の育種に止まらず、生合成経路の律速部位の解析に応用することができ、さらに育種を次のステップに進める上で有用な多くの情報が得られた。