ホルボール誘導体の発癌プロモーション活性に関する構造活性相関については、首藤-板井、岸、Wender等により報告されているが、そこでは主に、12位の疎水性基、及び3、4、6、9位に有する酸素官能基群が活性発現に必要であるとされている。12位については、疎水性基を持たないプロストラチンが発癌プロモーション活性を持たないことから、その必要性は明らかである。6位ヒドロキシメチル基については活性発現に必要とされ、化合物1、2の活性の比較によりその確認ができると考えられる。また、11位メチル基、及び13位アセトキシ基に関しては、レセプターへの結合には関与をしないとされているが、その証明は成されておらず、化合物1とPMAとの比較により情報を得られると考えられる。既に、柴崎らは化合物5の立体選択的合成に成功している。

　本研究では、化合物3、4を合成し更に、構造活性相関の研究上重要と考えらる1、2の合成に成功し、PKCとのbinding assayを行った。なお、ホルボールは高度に官能基化されたジテルペノイドでありWenderらのラセミ体での全合成を含めて、基本骨格の合成は四例のみである。本研究は光学活性体での合成であり、これも本研究の大きな特長の一つである。

Figure1.Target Molecules.

　標的化合物1、2の合成は、Scheme1.に示す逆合成解析により計画した。A環は分子内アルドール反応により、またB、C環は、それぞれ分子内二トリルオキシド環化付加反応を利用して、立体特異的に構築することとした。原料は、光学的に純粋で、安価に入手容易な化合物(+)-3-careneを用いた。

Scheme1.Retrosynthetic Analysis.

　柴崎らの報告している方法に従い12工程で得られる10を大量に合成し、検討を開始した。

Scheme2.Synthesis of intermediate 9.

　10を速度論的に脱プロトン化後、ジルコニウムエノラートへと導き、次いでフェニルセレネニル化しmCPBAを用いて酸化して、,-不飽和ケトンとした。これをジメチルジオキシランを用いてエポキシ化し、-エポキシド11のみを3ステップ82%で得た。なお、本工程において塩基性条件下でのエポキシ化を行うと、ピバロイルオキシ基が-脱離を起こし、収率の大幅な低下が見られた。11のエポキシドをアルミニウムアマルガムにより還元的に開環後、TBSで保護し、ケトンへのグリニャール試薬の付加反応を行った。なお、本反応では立体は完全に制御され-側にビニル基が導入された目的の立体配置を有する化合物のみを与えた。 次に、TBAFを用いて、脱保護して12を4ステップ85%の収率で得た。12の12位に相当する水酸基をDMSO中SO₃・pyridine錯体を用いて酸化し、NaBH₄還元により水酸基の立体配置を反転した後(:＝9:1)、TBSエーテルとして保護し、化合物1、2の共通中間体9を合成した。

Scheme3.Synthesis of 1.

　9の三級水酸基をSEMエーテルとして保護し、LAHを用いて脱ピバロイル化を行い、DMSO中SO₃・pyridine錯体による酸化を経て13とした。この13と14との縮合反応を、トルエン中LiBr存在下LHMDSを用いて行うことにより、15を単一成績体として95%の収率で得ることに成功した。なお本反応において塩基としてKHMDSを使うとSEMO基の-脱離が起こり、また溶媒としてTHFを用いると立体選択性の低下がみられた。次に15をDIBAHを用いて1,2-還元後、TBDPSで保護してた後、PMB基をDDQを用いて脱保護し、生じた水酸基をトシル化、ヨウ素化、ニトロ化し、16を合成した。16の分子内ニトリルオキシド環化付加反応はbenzene中触媒量のEt₃N存在下、p-ClC₆H₄NCOを用いて行った。反応は、17に示す遷移状態を経て進行したと考えられ、18を単一成績体として、91%の収率で与えた。18のイソキサゾリン環を大過剰の硼酸存在下、ラネーニッケルW-2を用いて還元的に開環し、19へ93%の収率で変換した。次にアルキニルセリウム試薬を用いたアシルアニオン等価体の導入を行なった。原料のケトンはエノール化しやすく、CeCl₃を添加せずに反応を行うと、原料を回収するのみであった。また、本反応では20に示す反応中間体を経由するヒドロキシ基関与の疑似分子内求核付加反応であると考えられ、化学収率こそ20%と低いものの、変換収率では定量的に進行し、更に立体は完全に制御され21を単一化合物として与えた。次に、DMSO中SO₃・pyridine錯体を用いてアルデヒドとした後、二価の水銀を用いて三重結合をケトンへと変換し22へ導いた。なお本工程は、一級水酸基を酸化する前に三重結合の変換を行うと、分子内でヘミケタールを形成してしまうことが、化合物5の合成研究から示唆されている。次にLDAを用いて分子内アルドール反応を行った。反応成績体は環の歪みのためかレトロアルドール反応を起こしやすく、単離精製することなく次の反応を行う必要があった。すなわち、メシル化及び-脱離までを1ポットで行うことにより、,-不飽和ケトンとしA環の構築に成功した。次に、TBAFに続きHF-pyridineで処理して脱保護を行いテトラオール体とした後、20位の一級水酸基をトリチルエーテルとして選択的に保護し、二級水酸基へのアシル化を行い、TFAを用いてトリチル基を脱保護し、化合物1の合成を行った。

　ここに、12位に疎水性基を有し、活性発現に必要とされる官能基を全て備え、天然のホルボールと同じ骨格を持った化合物の光学活性体での合成に成功した。

　化合物1の立体化学については、化合物23のNOEを測定することにより決定した。

Figure2.NOE observations of 23.

　6位にヒドロキシメチル基を持たない化合物2も、化合物1と同様の方法で合成した。すなわち、13よりアルデヒド34へ導き、Wittig反応を経由し35とした。なお、このWittig反応では、目的のシス体のみが得られている。次に、ニトロ体36へと導き、分子内二トリルオキシド環化付加反応を行い38を得た。イソキサゾリン環を開環し39とした後、アシルアニオン等価体の導入を行い41へと変換し、更に42へと導いた後、分子内アルドール反応を行い、疎水性基の導入を行い化合物2の合成に成功した。

Scheme4.Synthesis of 2.

Scheme5.Synthesis of 3 and 4.

　12位に酸素官能基を持たない化合物3、4は化合物10より1、2と同様の方法で合成を行った。

　合成した化合物1、2についてPKCとのbinding assayを行った。すなわち、ラット脳より得られたPKC(サブタイブ、、のmixture)に、tritiumラベルしたphorbol-12,13-dibutylate(PDBu)10nMに対してcoldのPMA、1、2の3薬剤をそれぞれ競合結合させた。その結果、1はPMAの約百分の一のbinding affinityを示し、6位にヒドロキシメチル基を持たない2は10^-5MでもPDBuの結合阻害を起こさなかった。そこで12位疎水性基の短い化合物を合成し、binding assayを行った。その結果、C-10の脂肪酸エステルを持つ化合物33において極大のbinding affinityを示すことが明らかとなった。

　blumbergらのPKCのPMA結合部位であるCys2とのX線結晶構造解析によるPMAとの結合様式においては、C環上部より上の部位はPKCの膜への移行に関与すると考えられている。上記のbindingassayの結果は特に13位アセトキシ基の欠如による脂溶性の増加分を、12位疎水性基の長さで埋め合わせていると考えることができる。PMAと1とでは、構造上の違いは11位及び13位の二つの置換基の有無だけである。研究開始時に行われた分子力場計算により得られた最安定コンフォメーションについては、11位あるいは13位置換基の有無による変化は見られておらず、以上の推察を支持している。今後、更に生物化学試験を実施することによって、細胞内情報伝達機構の解明に寄与できるものと考えられる。

図表Table1.Effect of Phorbol Analogs on the Inhibition of [³H]PDBu Binding to PKC. / Table 2.