GBL投与の影響を脳波および行動薬理学的な面から観察した。薬物はすべて腹腔内注射により投与した。脳波は、無麻酔、無拘束下で左右大脳皮質表面からの双極誘導により測定した。GBLでは、50 mg/kgの投与で脳波上に変化は認められなかったが、100 mg/kg投与で、3-6 HzのSWDsが出現した。GBL 200 mg/kgではspike and inhibitionが出現した。SWDsの出現は、GABA_B受容体のアンタゴニストであるCGP 35348(200 mg/kg)および欠神発作治療薬であるエトスクシミド(200 mg/kg)の前処置で抑制された。SWDsの出現に伴って行動の停止が認められたので、行動量測定装置(Digiscan)により、1群5匹のマウスを用い、暗期に自発運動量を測定したところ、GBL(100 mg/kg)の投与により、投与5分後から、自発運動量は著しく抑制された。CGP 35348(200 mg/kg)はGBL投与による自発運動量の抑制に拮抗したが、単独では自発運動量に影響を与えなかった。以上より、マウスにおいてもGBLにより欠神様発作症状が発現し、欠神発作の実験モデルとなることが示された。また、GBLによる欠神発作発現にGABA_B受容体が関与することが示された。

　GBLおよびGHBがGABA_B受容体に親和性を持つか否かをGABA_Bアゴニストの[³H]バクロフェンを用いた受容体結合実験で検討した。受容体結合実験を行うにあたり、[³H]バクロフェンの特異的結合に対する非特異的結合の割合の高いことが問題となったので、まず、マウス脳膜標品を用い[³H]バクロフェン結合の性状について調べた。マウス全脳膜標品を低濃度のTriton X-100(TX)で処置すると、非特異的結合は影響を受けなかったが、特異的結合が増加した。[³H]バクロフェン結合のScatchard plotは、高親和性と低親和性の2つの結合部位を持つことを示した。TX処置後も2つの結合部位を示したが、両部位のK_D値はTX未処置膜より低下した。しかし、最大結合数はTX処置で変化しなかった。バクロフェン以外のGABA_Bリガンドの結合親和性に対するTX処置の効果を[³H]バクロフェン結合の阻害曲線から検討したところ、TX処置は用いたすべてのアゴニストの親和性を有意に増大させたが、アンタゴニストの親和性には有意な影響を与えなかった。加齢の影響について調べたところ、大脳皮質膜標品における[³H]バクロフェン結合は、20ヶ月齢まで加齢による変化は認められなかったが、すべての月齢でTX処置により顕著な結合増加が認められた。一方、小脳においては3ヶ月齢で最も高い結合を示し、8ヶ月齢以上の月齢では結合の減少が認められた。TX処置の効果は1ヶ月齢で認められたが、3ヶ月齢以上では認められなかった。

　GBLおよびGHBのGABA_B受容体への結合についてTX処置の効果とあわせて検討したところ、GHBは[³H]バクロフェン結合を濃度依存的に抑制し、そのIC₅₀値はTX未処置膜では1.27 mM、TX処置膜では0.55 mMであった。GBL(1 mM)は、[³H]バクロフェン結合に影響を与えなかった。これらの結果より、GBLではなくGHBがGABA_B受容体にアゴニストとして作用することが示された。

　マウス脳より核抽出液を調製し、³²Pでラベルした2本鎖DNAをプローブとしてゲルシフトアッセイ法により、核内cyclic AMP responsive element(CRE)およびactivator protein 1(AP-1)DNA結合活性に及ぼすGBL投与の影響について検討した。欠神様発作症状を発現させる用量のGBL(100 mg/kg)を投与し、全脳においてDNA結合活性の経時変化を測定した。CRE結合活性はGBL投与5分後から上昇傾向を示し、30分後にピークとなり、90分後には投与前のレベルに回復した。一方、AP-1 DNA結合活性は投与5分後にすでに有意な上昇を示し、15分後にはほぼピークに達し、60分後までプラトーとなり90分後でも投与前のレベルより有意に高かった。また、GBL(100 mg/kg)投与30分後のCREおよびAP-1 DNA結合活性は用量依存的に上昇した。SWDsの出現および欠神様発作症状を顕著に抑制した用量のCGP 35348(200 mg/kg)を前投与するとGBL(100 mg/kg)によるCREおよびAP-1 DNA結合活性の上昇は抑制された。DNA結合活性に対するGBL(100 mg/kg)投与の影響を脳各部位において検討したところ、CRE結合活性は大脳皮質および視床(中脳を含む)で有意な増加が認められた。AP-1 DNA結合活性は大脳皮質、視床で最も高く、視床下部でも有意な増加が認められた。海馬、小脳、橋・延髄においては両結合活性とも有意な変化は認められなかった。大脳皮質および視床におけるGBLによるCREおよびAP-1 DNA結合活性の上昇は全脳の場合と同様にCGP 35348(200 mg/kg)の前処置によって完全に抑制された。GBLによる核内CREおよびAP-1 DNA結合活性の上昇がてんかん欠神様発作症状が発現したマウスの大脳皮質および視床で認められ、海馬では認められなかったことや、欠神様発作症状を抑制する用量のCGP 35348投与で抑制されたことから、これら転写調節因子の誘導には、大脳皮質および視床のGABA_B受容体が関与しており、これら転写調節因子の誘導が欠神発作発現と密接に関連したものであると考えられた。

　CREおよびAP-1 DNA結合の特異性を確認するため、GBL投与後の大脳皮質において各種転写調節因子の抗体の影響をゲルスーパーシフトアッセイ法により調べた。CRE結合活性はCRE binding protein(CREB)抗体でスーパーシフトし、c-Jun、c-Fos抗体によっては影響を受けなかった。これは、CRE結合活性の上昇がCREBによるものであることを示している。一方、AP-1 DNA結合活性は、c-Junおよびc-Fos抗体によってバンドが消失し、CREB抗体により一部スーパーシフトが認められた。これらの結果は、AP-1 DNAに結合する複数のタンパク複合体がGBL投与により誘導されることをを示している。

　マウス小脳顆粒細胞初代培養系の細胞内Ca²⁺濃度はGHB処置で一過性に上昇し、この上昇はCGP 35348(1 mM)やCGP 55845(1 M)により抑制された。この系において、核内CREおよびAP-1 DNA結合活性に対するGHBの影響を検討したところ、GHB(0.1-3 mM)は、CREおよびAP-1 DNA結合活性を濃度依存的に上昇させた。GBLは、3 mMでも両結合に影響を与えなかった。1 mM GHBによるCREおよびAP-1 DNA結合活性の増加は、CGP 35348(1 mM)またはCGP 55845(1 M)の共存により抑制された。また、両結合活性の上昇は、細胞内Ca²⁺キレート剤であるBAPTA-AM [1,2-bis(2’-aminophenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid tetraacetoxymethyl ester]や細胞内小胞のCa²⁺-ATPaseを阻害してCa²⁺を枯渇させるthapsigarginの前処置で拮抗された。これらの結果より、GHBによるCREおよびAP-1 DNA結合活性の増加には細胞内ストアからのCa²⁺遊離によるCa²⁺濃度の上昇が重要な役割を果たしていることが示された。