永井らが用いたウサギのSM1/2のC末端DNAをプローブとして得たATG開始コドンを含むウサギcDNAクローンを用い、マウスcDNAクローンを得た。さらに、カセットPCR法により、目的のマウスSM1/2遺伝子の5’プロモーター領域と第一イントロンを含むクローン、MF31、をクローニングすることに成功した。マウスの大動脈・腸管・子宮由来のmRNAを用いてプライマー伸長法で決定された転写開始点は、ATG開始コドンから106bp上流の一カ所に同定された。第一エクソンは90bpの長さで、10kbp以上の第一イントロンをはさんで、16bpのノン・コーディング領域を持つ第二エクソンへとつながることが明らかとなった。また、MF31の転写開始点から1526bpの領域のシークエンスを行った。それぞれ転写開始点から、-28bpにTATA box、-43bpにGATA box、-965bpと-1297bpにCArG box、そして8個のE-boxを認めた。M-CAT.MEF-2が結合するコンセンサス配列は認められなかった。

　シスエレメントを解析するために、5’フランキング領域を種々の長さに欠失させたSM1/2プロモーターを組み込んだルシフェラーゼ・レポーター遺伝子を、各種細胞に一過性に導入し、転写活性を比較検討した。この時、一緒にヒトエロンゲーションファクター1のプロモーターを持つガラクトシダーゼ・レポーター遺伝子を細胞に導入し、転写効率を補正した。まず、ウサギ大動脈平滑筋由来の血管平滑筋細胞C2/2にSM1/2が発現していることをRNase Protection Assayにて確認した後、転写活性を比較検討した。3.4kbp、1226bpのプロモーター領域を含むプラスミドの転写活性は、プロモーター・エンハンサーを含まないレポーター遺伝子、PGVB、に比較して50倍近い活性の上昇を認めた。-188bpまで欠失させたコンストラクトでも転写活性はそれほど変化しなかったが、より近位、特に、-92bpと-80bpの欠失で転写活性は顕著に低下し、この領域に活性増加作用領域が存在する可能性が示された。-72bpまで欠失させたプラスミドの転写活性はPGVBの9倍程度あるので、より近位に必須のシスエレメントが存在している可能性が考えられた。これらの実験結果を確認するために、酵素分散法により得たウサギ大動脈平滑筋細胞の初代培養細胞で同様な実験を行ったところ、いずれの転写活性も他の非平滑筋細胞での転写活性よりも15倍以上の高値を示した。また、-92bpと-80bp間の欠失による転写活性の低下は非平滑筋細胞での低下に比べて顕著であった。

　シスエレメントと核タンパク質の結合について解析するために、-103bpから-68bpの領域のオリゴヌクレオチドSMS80をプローブとして、C2/2の核タンパク質を用いたゲルシフト分析を行い、配列に特異的な結合活性の存在を証明した。次に、SMS80の塩基配列に変異を加えたオリゴヌクレオチドを数種用い競合阻害させる実験から、-89bpに存在するCCTCCC配列が、平滑筋細胞における特異的なタンパク質-DNA結合に重要であると考えられた。より近位の-61bpに存在するCCTCCC配列についても同様に、-89bpのCCTCCC配列に結合するタンパク質が結合していることが示された。

　次に、CCTCCC配列と核タンパク質の結合を実際に阻害すると、転写活性がどのように変化するのかを知るため、レポーター遺伝子を用いた実験を行った。-89bpのCCTCCCに変異を導入したBM80、-61bpのCCTCCCに変異を導入したBM60、両方に変異を導入したBMDの転写活性は有意に低下し、それぞれ47%,49%,26%を示した。したがって、89bpと61bpに存在するCCTCCC配列が、実際にSM1/2遺伝子の発現に重要であることが示された。

　既知の転写因子結合コンセンサス配列、CACC-binding boxとSp1-binding boxを含むオリゴヌクレオチドはグルシフト分析の結合を競合阻害したことから、これらの配列はCCTCCCと配列が異なっているが、CCTCCC配列結合タンパク質とも結合できると考えられた。これまでに、CACCC配列とその結合タンパク質の結合が、組織特異的な発現に重要な役割を果たしているという報告がいくつか知られている。グロビン遺伝子プロモーターのCACCboxに結合するタンパク質として、Zinc fingerを持つタンパク質、EKLFがクローニングされている。最近、EKLFのノックアウトマウスが解析され、赤血球特異的な発現が低下し、重篤なサラセミアをおこし、胎児のうちに死亡すると報告された。臨床的にも、CACCC配列中の変異がサラセミアを起こす例が知られている。他に、トロポニンCやミオグロビン遺伝子の筋特異的な発現に重要なCACCboxに結合するタンパク質として-10kDaのタンパク質が、また、T細胞受容体遺伝子プロモーターのCACCCに結合するタンパク質として、やはりZinc fingerを持つタンパク質、htが報告されている。したがって、CACCC配列に結合するタンパク質として、様々なZinc Fingerを含む転写因子の存在が考えられる。SM1/2遺伝子プロモーターのCCTCCC配列も、Sp1以外にZinc Fingerを含む転写因子との結合によって、発現調節を受けている可能性がある。

　Sp1に対するポリクローナル抗体を用いたゲルシフト分析で、SMS60、SMS80ともにスーパーシフトを起こし、シフトしたバンドにSp1が含まれていることが示された。一般には、Sp1は細胞全般的に発現していると考えられているが、組織特異的発現に関与しているとする例がいくつか知られている。まず、Sp1がco-factorとして機能的な複合体を形成する例である。心筋アクチンの筋特異的な発現には、Sp1、SRF、MyoDが必要であり、骨格筋トロポニンIでは、Sp1、MyoDが必要である。SM1/2遺伝子に適応すれば、CCTCCCのより下流に細胞特異的な発現に関与する領域があり、共同してその作用を発現していると考えることができる。-43bpに存在するGATA boxは重要な候補であるが、GATA boxに変異を導入しても転写活性に変化を認められず、このGATA boxはSM1/2の転写活性に重要な役割を果たしていないと考えられた。次は、Sp1が他の転写因子と細胞特異的な相互作用を起こす例である。たとえば、Rb遺伝子タンパク質が細胞の種類によって、c-fosやTGF1の発現を規定していることが知られている。SM1/2遺伝子プロモーターのCCTCCC配列もSp1と作用し、発現を調節している可能性がある。

　最近、報告されたウサギのSM1/2遺伝子のプロモーター領域の解析と比較した結果、類似した配列が同定できた。ひとつの領域は、120bp程度までの近位に存在し、TATA box、二連のCCTCCC配列を含んでいる。これらの配列は、マウスとウサギで共通に保存されており、SM1/2遺伝子発現に重要であるとする仮説を支持するものである。また、平滑筋細胞に比較的特異的に発現する平滑筋アクチン遺伝子のプロモーターにもGGGAGG(CCTCCCの裏)配列が連なって存在しており、SM22遺伝子のプロモーターには、機能は不明だが、CACCC Boxの存在が報告されている。もう一つのマウスとウサギで類似する配列は、マウスの1000bpと1500bpの間の領域であり、二つのCArG boxを含んでいる。しかし、マウスに認められたGATA box、8個のE-boxは、いずれもウサギでは保存されておらず、実験結果からも有意な働きは認められなかった。ウサギのプロモーターの解析結果からは、2266bpに存在するMEF2-likeな配列が重要な働きをしていると報告されているが、マウスではこれに相当する配列を認めなかった。このような結果の相違が生じた理由は種の違いで説明できるかもしれないが、明らかではない。

　以上の結果から、二連のCCTCCC配列とその結合タンパク質との結合が、平滑筋特異的な遺伝子発現を規定していることを示した。結合タンパク質として、Sp1またはZinc Fingerを含む転写因子が関与している可能性が高く、今後これらの転写因子のクローニング、機能解析について検討が必要である。