7回細胞膜を貫通する構造を有するG蛋白質共役受容体の膜貫通領域の相同性の高い部分(第3および第6細胞膜貫通部分)から設計したoligonucleotideを用いて、U937細胞由来mRNAをcDNAとし、これを鋳型としてpolymerase chain reaction(PCR)法により得た2種類の遺伝子断片を用いてヒト遺伝子ライブラリー(EMBL3)をスクリーニングし、2種類の遺伝子の全長を得た(ヒトMCR-1およびMCR-3)。さらにこの2種類の遺伝子に特徴的に保存されている領域(第2細胞質ループおよび第7膜貫通部分)からdegenerated oligonucleotideを設計し、ヒトあるいはマウス遺伝子DNAを鋳型としてPCRを実施し、得られた新たな3種類の遺伝子断片によりヒトあるいはマウス遺伝子ライブラリーをスクリーニングし、3種類の遺伝子の全長を得た(ヒトMCR-2およびMCR-4、マウスMCR-5)。この5種類の遺伝子中の2種類は-MSH受容体(MCR-1)およびACTH受容体(MCR-2)であることが最近明らかにされ、残りの3種は新規の受容体(MCR-3,4,5)であった。これらの受容体は、hydropathy plotの結果7回膜貫通構造を有し、その翻訳領域のアミノ酸組成を既知の受容体と比較すると、2アドレナリン、ドパミン2AおよびアデノシンA1,A2受容体との相同性が比較的高かった。また、5種類の受容体間の相同性は、塩基レベルで約60%、アミノ酸レベルで約45%であった。

　-MSHあるいはACTHの作用は、それぞれMCR-1およびMCR-2を介して発現すると考えられるが、メラノコルチンの中枢作用等に関与する受容体は不明であった。そこで新規のMCRのこれらの作用への関与を詳細に検討するため、受容体発現組織をノーザンプロット解析により検討した。MCR-1がmelanoma細胞に、MCR-2が副腎皮質に発現していたのに対しMCR-3は胎盤、脳、胃、十二指腸および膵に、MCR-4は脳に、MCR-5は骨格筋、脾、肺に発現が認められた。またMCR-3,4,5はmelanomaあるいは副腎皮質での発現は認められなかった。さらに、in situ hybridizationにより、MCR-3はラット脳の視床下部および大脳皮質に存在し、MCR-4はラット脳CA1およびCA2領域に強く発現していることが明らかになった。従って、MCR-3はbrain-gut receptorの一種と考えられ、MCR-4とともに脳における発現が強いので、従来より報告されていたメラノコルチンの中枢作用、例えば行動、学習、記憶の保持に関与する受容体である可能性が高いと考えられた。またMCR-5はメラノコルチンの末梢での幅広い作用を担っていると考えられた。

　新規受容体群であるMCR3〜5のリガンド認識の特異性を明らかにするため、クローン化受容体発現細胞における各種リガンド刺激に対する反応性をcAMP増加を指標に比較検討した。

　MCR-3は-および-MSHに対してACTHあるいは-MSH刺激の場合と同等の反応性を示したが、MCR-1においては反応性の低下が認められた。MCR-3はACTH、,,-MSH刺激に対して同等に反応するので、おそらくペプチド鎖の中心の7つのペプチド(core heptapeptide:[Met-Glu(Gly)-His-Phe-Arg-Trp-Gly(Asp)])を特異的に認識していると考えられた。これに対して、MCR-1においてはACTH1-10およびACTH4-10とも最大反応を惹起できなかった。おそらくMCR-1においてはN末端およびC末端のペプチドが、その活性発現に重要であると考えられた。

　MCR-4では-MSHは-MSHおよびACTHと同等の効力を示した。さらにMCR-4におけるリガンド認識機構を検討するため、-MSH誘導体ペプチドを合成し、その効力を検討した。Table 1.に示すように、-MSHのPhe¹²をPro¹²に置換したペプチドでは-MSHに比較し効力は増し、一方Tyr²をPhe²に置換したペプチドの効力は-MSHより若干強いものであった。以上の成績より、-MSH、ACTH、-MSHはPro¹²を有するが、効力の弱い-MSHはProの位置はPheであるのでACTHのPro¹²がMCR-4への結合に重要であると考えられた。さらにTyr²もMCR-4への結合に一部寄与すると考えられた。

　MCR-5は-MSHおよびACTH1-13に対しては同等の反応性を示したが、ACTH1-39に対する反応性が若干低く、ACTH1-39のN末端部分のアミノ酸が抑制的に作用している可能性が考えられた。またACTH4-10に対しては殆ど反応しないので、-MSHのcore heptapeptide以外のC末端およびN末端のアミノ酸の重要性はMCR-4におけるそれよりも高いと考えられた。受容体結合試験においても-MSHおよびACTH1-13に比較してACTH1-39の効果は弱かった。

Table 1.EC50 values of various ligands acting on MCR-3 and MCR-4

　以上の成績からMCR-3はACTH4-10で示されるcore heptapeptideを認識し、またMCR-4ではTyr²およびPro¹²が結合に寄与すると考えられ、MCR-5はcore heptapeptideはspacerとして機能し、結合にはC末端およびN末端に連なるアミノ酸が寄与すると考えられた。

　MCR-3をHepa細胞に発現させ、ACTHおよび-MSH刺激によるcAMP量およびinositol phosphates(IPs)量に及ぼす効果を検討した。ACTHおよび-MSHは濃度依存的にcAMPを増加させ、両者の効力は同程度でありEC50は約10^-11Mであった。同じ細胞において、ACTHおよび-MSHは10^-11M以下の濃度ではIPsを増加させたが、10^-11Mより高濃度では減少させ、濃度依存曲線は二相性であった。この現象への細胞内cAMPの関与を検討するため、MCR-3発現細胞をforskolinあるいはdibutyryl cAMPで処置すると-MSH(10^-11M)刺激によるIPs応答は抑制され、さらにcAMPの拮抗剤であるRpcAMP処理により-MSH(10^-8M)刺激によるIPs応答の抑制は若干解除された。またcAMP依存性protein kinase阻害剤のH-89処置により、10^-11M以上の-MSHでも濃度依存的なIPs上昇が認められた。G蛋白質共役受容体の細胞内情報伝達に主要な役割を演じているのは第3細胞質ループと考えられ、この領域においてcAMPがIPsの応答を調節している可能性が考えられた。そこでMCR-3の該当部分をイヌヒスタミンH₂受容体の相当部分に組み込むことによりキメラ受容体を作製し、ヒスタミン刺激によるIPs上昇について検討した。その結果、ヒスタミンH₂受容体ではcAMPおよびIPsともヒスタミンの濃度依存的に増加したのに対し、キメラ受容体においてはMCR-3と同様に、IPsの二相性の反応が認められた。従って、MCR-3においてはcAMPおよびIPsが細胞内情報伝達に関与し、cAMPによるIPs応答の調節は受容体の第3細胞質ループにおけるcAMP依存性protein kinaseの作用によりなされていると考えられた。

　以上の成績は、今回初めてクローニングに成功した新規のメラノコルチン受容体(MCR-3、MCR-4およびMCR-5)が、従来知られていたメラノコルチンの作用である色素沈着あるいは副腎皮質刺激などの作用の他に、中枢での役割あるいは骨格筋での役割といった多様な生理作用を有することを説明するのに有用な情報を与えること、さらに各受容体に特異的な作働薬あるいは拮抗薬作製のための有益な材料となることを示すものである。