細胞は細胞外からの刺激を細胞膜上の受容体で受け取り、細胞内に伝達する。その伝達様式には、細胞膜上のイオンチャンネルの開口、蛋白のリン酸化、受容体に共役して存在するG蛋白による機能蛋白質の活性化が知られている。特にG蛋白共役型のシグナル伝達では、シグナルを伝達する新たな分子が産生される。これをセカンドメッセンジャーと呼び、サイクリックAMP,イノシトール1,4,5-3リン酸(IP₃)、1,2-ジアシルグリセロール、Ca²⁺がそのような役割を担っている。

　IP₃は細胞外からの刺激に引き続いてG蛋白に活性化されるホスホリパーゼCの働きで、細胞膜リン脂質のホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェートの加水分解により産生される。IP₃は細胞内Ca²⁺ストア上のIP₃レセプター(IP₃R)と結合して細胞内にCa²⁺を放出し、Ca²⁺依存性の機能蛋白質を活性化して、最終的に受精、細胞の分泌、増殖などあらゆる生理現象に関わることが知られている。

　IP₃Rは一つの分子内にIP₃結合サイトとCa²⁺チャンネル領域を持つ分子である。IP₃Rは最初小脳プルキンエ細胞特異的に発現の豊富な蛋白質P400として同定され、cDNAがクローニングされた。既存の細胞膜上にある電位依存性イオンチャンネルとは構造を異にし、同じ細胞内Ca²⁺を制御する分子であるリアノジンレセプター(RYR)と相同性を示すことから、細胞内膜系に存在する新たなチャンネルファミリーの存在が明らかになった。しかしIP₃の結合を指標とした生化学的な実験の結果は、1つのIP₃Rだけでは説明しきれず、サブタイプの存在を示唆していた。

　またCa²⁺シグナリングの姿は、上記のような分子生物学の発達によって関連分子の実体が明らかにされつつあることと共に、Ca²⁺蛍光指示薬,共焦点レーザー顕微鏡などのCa²⁺を可視化する技術の進歩によって飛躍的に理解されるようになった。なかでも注目を集めているのは、一定の刺激物質存在下で細胞内Ca²⁺濃度が変動すること、また細胞内Ca²⁺がある特定の領域から周囲へ向かって伝播するという現象である。このようなCa²⁺の振動が起こるメカニズムと生理的意義について、現在盛んに研究が行われている。

　以上のような背景のもと、本研究では、ヒトにおけるCa²⁺シグナリングを理解するためにヒト細胞株を材料に、新規IP₃RサブタイプのcDNAクローニングを行った。またサブタイプの発現分布や細胞内局在と、刺激におけるCa²⁺動員の関連性について検討を行った。

　細胞内情報伝達において、細胞内カルシウム(Ca²⁺)濃度の制御は重要な意義があるとされている。すなわち細胞内Ca²⁺濃度は、刺激に対応して細胞内Ca²⁺貯蔵庫より細胞質に放出されることで上昇し、その後細胞外からの流入が生じるとされている。しかし細胞外からのCa²⁺流入機構はよく研究されているが、細胞内からのCa²⁺動員機構は、明らかでない。本研究は細胞内からのCa²⁺動員に関与するイノシトール(1,4,5)3リン酸レセプターに着目し、その分子の多様性を明らかにしてそれらが細胞内情報伝達の中で果たす役割を考察したもので、3章よりなる。

　第1章では、イノシトール(1,4,5)3リン酸レセプターの新規タイプである、タイプ2、3レセプターのヒトcDNAクローニングを行い、イノシトール(1,4,5)3リン酸レセプターに少なくとも3つのタイプが存在することを明らかにした。タイプ3レセプターについてCOS細胞での発現に成功しそのリガンド結合特異性を検討したところ、タイプ1レセプターと同様にイノシトール(1,4,5)3リン酸と結合特異性を示し、イノシトール(1,4,5)3リン酸がリガンドとして用いられていることが示唆された。またその結合親和性は、タイプ1、3レセプター間で違いは認められなかった。ヒト血球系細胞株を用いて各タイプの発現様式を検討し、細胞種によって発現するタイプに特徴がある可能性を示した。

　第2章では、ラットを用いてイノシトール(1,4,5)3リン酸レセプター各タイプの発現を、組織化学的な方法を用いて検討した。タイプ1レセプターは、もともと脳の神経細胞に多く発現していることが知られているが、タイプ2レセプターはマイクログリア細胞に、タイプ3レセプターがアストログリア細胞にと、細胞種によって発現が分離していることを示した。末梢組織では、タイプ2レセプターが顎下腺導管、精巣上体輸精管、腎臓集合管に発現していることを明らかにし、タイプ2レセプターが水やイオンの再吸収の機能を有する細胞に特徴的に発現していることが示唆された。その他気管支や小腸の分泌性上皮細胞にも発現を認めている。さらに、タイプ3レセプターは、各種組織の細血管や毛細血管に限局して発現していることを明らかにした。このようにイノシトール(1,4,5)3リン酸レセプター各タイプは細胞種によって特徴的な発現を示し、しかもそれらが細胞機能と密接に関与していることが示唆された。

　第3章では、タイプ2レセプターが多く発現している顎下腺をモデルに、生理的刺激によるイオン再吸収時におけるCa²⁺動態を解析することによって、タイプ2レセプターの機能を検討した。上皮細胞は極性を持つことが知られており、タイプ2レセプターは、顎下腺上皮細胞の頂部に限局して発現が認められた。また導管を形成する上皮細胞の中でもタイプ2レセプターを特に多く発現している細胞が存在することを見い出した。顎下腺を酵素処理することによって導管を単離し、リアルタイム共焦点レーザー顕微鏡を用いてムスカリン作動性刺激による導管での時間空間的なCa²⁺分布について解析を行った。刺激に応じて、導管上皮細胞の頂部でCa²⁺の発火が起こり、細胞の基底部に向かってCa²⁺の波が移動することを示した。しかし全ての細胞がこのような反応を示す訳ではなく、反応の遅い細胞ではCa²⁺が拡散するように上昇した。この細胞内Ca²⁺動態の違いとタイプ2レセプターの極性を持った発現、細胞毎に異なる発現量が関与していることを明らかにするために、Ca²⁺動態を観察した導管をタイプ2レセプター抗体で免疫染色を行い、細胞頂部のCa²⁺が強く発火する部位とタイプ2レセプターが多く発現する部位が一致することを示した。このことはタイプ2レセプターの細胞内局在が顎下腺導管のCa²⁺動態に深く関わることを示し、細胞基底側で受容した刺激を細胞頂部に伝達し、細胞頂部で起こる水分やイオンの再吸収を効率的に行う機構の一端をタイプ2レセプターの局在が担っていることが示唆された。

　以上要するに、本研究は細胞内Ca²⁺濃度制御による細胞内情報伝達の多様性に着目し、これを司るイノシトール(1,4,5)3リン酸レセプターが3タイプ存在することを明らかにし、それらの発現が細胞種によって特徴があることを示し、特に生理的な刺激による細胞内Ca²⁺動員においてイノシトール(1,4,5)3リン酸レセプターの細胞内局在の意義を明らかにしたもので、学術上、応用上貢献するところが少なくない。よって審査委員一同は本論文が博士(農学)として価値あるものと認めた。