ビタミンDは活性型のホルモンとして標的組織においてその作用を発揮する前に体内において2段階の修飾を受けることが知られている。皮膚で紫外線により合成された、又は食物より摂取されたビタミンDは、肝臓に運ばれまず25位が水酸化を受ける。この水酸化はあまり厳密にコントロールされておらず、生成した25-hydroxyvitamin D₃[25(OH)D₃の血中濃度は主にビタミンDの供給状態を反映すると言ってよい。その後、この25(OH)D₃は腎臓に運ばれ、主に腎臓の近位尿細管において1位、又は24位が水酸化を受けることにより、活性型の1,25-dihydroxyvitamin D₃[1,25(OH)₂D₃]に又はやや不活性型の24.25-dihydroxyvitamin D₃[24,25(OH)₂D₃]へと変換される。この腎臓における25(OH)D₃の2つの水酸化は厳密にそして逆方向にコントロールされており(代謝スイッチ)、それにより体内のビタミンD内分泌系の活性が調節されていることが知られている。

　このように腎臓は体内の1,25(OH)₂D₃の主要な内分泌臓器であるが、同時にビタミンD受容体(VDR)を発現する標的臓器としても知られている。そこでまず腎臓でのビタミンDの代謝および作用の部位を探る目的で、microdissectionにより正常ラットの尿細管の各セグメントを分離採取し、mRNAを抽出後RT-PCR法を用いて24水酸化酵素(24-OHase)及びVDRのmRNAの発現を調べた。その結果、24-OHase mRNAは近位尿細管に集中してその発現が認められるのに対し、VDR mRNAは近位尿細管を含めほぼ普遍的にその発現を認めた。前述したように近位尿細管は体内の1,25(OH)₂D₃の主要な産生組織であるが、同時にそのレセプターを発現する標的組織でもあることになる。しかしながら1,25(OH)₂D₃は25(OH)D₃を活性化する1水酸化酵素(1-OHase)を抑制し、不活性化する24-OHaseを誘導することが知られており、これにより矛盾が生じることになる(図1)。つまり近位尿細管での1,25(OH)₂D₃の産生が亢進した状態で、その細胞にVDRが存在すると24-OHaseは誘導され、1-OHaseは抑制されるはずである。しかし実際は近位尿細管での1,25(OH)₂D₃の産生が亢進した状態では24-OHaseは抑制され、1-OHaseは誘導されているわけで、このメカニズムから予想される結果は現実とは逆になってしまう。

図1.腎近位尿細管細胞にVDRが存在することの問題点細胞内で1,25(OH)₂D₃の産生が亢進している状態を示す。右のメカニズムから予想される結果は現実に起こっていることと反対である。

　この問題を説明するため、我々は近位尿細管での1,25(OH)₂D₃の産生が亢進しているときはVDRはなくなっているのではないかと考えた。またこのような近位尿細管でのVDRの発現量の調節が、ビタミンDの代謝スイッチを可能にすることに気付いた(図2)。

図2.ビタミンD代謝調節のモデル左端は正常の状態、中央は腎臓での1,25(OH)₂D₃の産生が亢進した状態、右端は代謝調節のメカニズムを示す。N:Nucleus,M:Mitochondria.

　そこでモデル動物を用いてこの仮説の妥当性について検討することにした。動物は3週齢のSDラットを用い、ビタミンDを含む、正常食、Ca欠乏食、P欠乏食にて飼育した後、実験に供した。1,25(OH)₂D₃の内分泌組織としては近位曲尿細管(PCT)を、また1,25(OH)₂D₃の標的組織としては皮質部集合管(CCD)及び十二指腸を用いた。腎臓はmicrodissection RT-PCR法により、十二指腸はmRNAを抽出後Northern blot法によりVDRならびに24-OHaseのmRNAの発現を検討した。

　その結果、PCTにおけるVDR及び24-OHase mRNAの発現は腎臓での1,25(OH)₂D₃の産生が亢進したモデル(Ca欠乏食群、P欠乏食群)では著明に抑制され、逆に腎臓での24,25(OH)₂D₃の産生が亢進したモデル(正常食群)ではその発現が充分に認められることを明らかにした。尚、CCD及び十二指腸でのVDR mRNAの発現は各群間で顕著な変化はなかった。十二指腸での24-OHase mRNAの発現は腎での1,25(OH)₂D₃の産生が亢進したモデル(Ca欠乏食群、P欠乏食群)において著明に誘導されていた。またCCDにおいてもCa欠乏食群において24-OHase mRNAの誘導がみられたが、正常食群のPCTと比べかなり低レベルであった。前述の如く、正常ラットにおいては、24-OHase mRNAはほぼ近位尿細管に集中してその発現を認めるが、これは近位尿細管が1,25(OH)₂D₃の主要な内分泌組織であり、自身の作り出した1,25(OH)₂D₃によりおそらくはautocrine/paracrineのような強力なメカニズムにより同部位において24-OHase mRNAが誘導されるためと考えられる。

　更にビタミンDを含まないCa欠乏食で飼育したラットにおいても、PCTにおけるVDR mRNAの著明な減少を認め、Ca欠乏食飼育によるPCTでのVDR mRNAの減少が1,25(OH)₂D₃産生亢進の結果ではないことが示された。

　尚、成長した雄のうずらにsex steroidを作用させると腎臓でのビタミンDの代謝スイッチがおこることが知られており、このモデルにおいても腎臓及び十二指腸よりmRNAを抽出後Northern blot法によりVDR mRNAの発現を調べた。その結果、Estradiol又はEstradiol+Testosteroneの皮下投与により腎臓の1-OHaseの活性が亢進した状態において、VDR mRNAの発現は腎臓では抑制されているが、十二指腸では殆ど変化がないことを明らかにした。

　これらは全てVDRの量をmRNAレベルで測定している点、そしてPCTにおけるVDR mRNAの減少が1,25(OH)₂D₃産生亢進の原因であることを直接的に示すものではない点等、若干の不備は残るが、今回の結果を最も合理的に説明できるのは図2のモデルであると考えた。つまり腎臓の近位尿細管においては、ビタミンDのレセプターの量が、そのリガンドであるビタミンDの活性化及び不活性化を調節していると結論した。しかし、この近位尿細管におけるVDR mRNAの発現調節の機序は未だ不明である。

　尚、VDR遺伝子の突然変異により、遺伝性低Ca血症性ビタミンD抵抗性クル病が発症することが知られているが、この病気の患者の血清1,25(OH)₂D₃レベルは高値を示す。今回の結果より考えると、変異により不安定で機能不全に陥ったVDRは、標的組織での1,25(OH)₂D₃の代謝を減少させるのみならず、腎臓での1,25(OH)₂D₃の産生を亢進させるため、血清の1,25(OH)₂D₃レベルが上昇すると考えられる。

　本研究は1,25-dihydroxyvitamin D₃[1,25(OH)₂D₃]の主要な内分泌臓器である腎臓でのビタミンDの活性化及び不活性化の逆方向への調節(代謝スイッチ)のメカニズムを探るべく、近位尿細管及びその他の組織においてビタミンD受容体(VDR)、24水酸化酵素(24-OHase)のmRNAの発現を調べたものであり、下記の結果を得ている。

　1.Microdissectionにより正常ラットの尿細管の各セグメントを分離採取し、mRNAを抽出後RT-PCR法を用いて24-OHase及びVDRのmRNAの発現を調べた。その結果、24-OHase mRNAは近位尿細管に集中してその発現が認められるのに対し、VDR mRNAは近位尿細管を含めほぼ普遍的にその発現を認めた。

　しかしながら1,25(OH)₂D₃は25-hydroxyvitamin D₃[25(OH)D₃]を活性化する1水酸化酵素(1-OHase)を抑制し、不活性化する24-OHaseを誘導することが知られており、これにより近位尿細管での1,25(OH)₂D₃の産生が亢進した状態は維持できないことになる。この問題を説明するため、近位尿細管でのVDRの発現量の調節が、ビタミンDの代謝スイッチを可能にしているという仮説をたて、モデル動物を用いて検討した。

　2.3週齢のSDラットを用い、ビタミンDを含む、正常食、Ca欠乏食、P欠乏食にて飼育した後、実験に供した。腎臓はmicrodissection RT-PCR法により、十二指腸はmRNAを抽出後Northern blot法によりmRNAの発現を検討した。その結果、近位曲尿細管(PCT)におけるVDR及び24-OHase mRNAの発現は腎臓での1,25(OH)₂D₃の産生が亢進したモデル(Ca欠乏食群、P欠乏食群)では著明に抑制され、逆に腎臓での24.25-dihydroxyvitamin D₃[24,25(OH)₂D₃]の産生が亢進したモデル(正常食群)ではその発現が充分に認められることを明らかにした。尚、皮質部集合管(CCD)及び十二指腸でのVDR mRNAの発現は各群間で顕著な変化はなかった。

　3.ビタミンDを含まないCa欠乏食で飼育したラットにおいても、PCTにおけるVDR mRNAの著明な減少を認め、Ca欠乏食飼育によるPCTでのVDR mRNAの減少が1,25(OH)₂D₃産生亢進の結果ではないことが示された。

　4.成長した雄のうずらにsex steroidを作用させると腎臓でのビタミンDの代謝スイッチがおこることが知られており、このモデルにおいても腎臓及び十二指腸よりmRNAを抽出後Northern blot法によりVDR mRNAの発現を調べた。その結果、Estradiol又はEstradiol+Testosteroneの皮下投与により腎臓の1-OHaseの活性が亢進した状態において、VDR mRNAの発現は腎臓では抑制されているが、十二指腸では殆ど変化がないことを明らかにした。

　以上、本論文は腎臓の近位尿細管において、ビタミンDのレセプターの量が、そのリガンドであるビタミンDの活性化及び不活性化を調節しているという仮説を支持する結果を示した。本研究はPCTにおけるビタミンDの代謝スイッチ機構の解明に重要な貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。