F.Succinogenes S85(＝ATCC19169)のセルロースへの付着に関与する物質についての情報を得るために、付着に及ぼす菌体の各種酵素による処理の影響を調べた。菌体のセルロース粉末への付着率は、核酸分解酵素や酸性フォスファターゼ処理では影響を受けなかったが、タンパク質分解酵素処理により著しく低下した。これらの成績は菌体表層におけるセルロース結合性タンパク質(cellulose-binding proteins,CBPs)の存在を想定させた。

　次いで、該菌保有のCBPsの検出を試みた。該菌のTween20処理により調製した溶菌液にセルロースを添加してCBPsをそれに結合させた。回収したセルロースを界面活性剤を含む緩衝液Aで洗浄し、セルロースに結合していないタンパク質や細菌細胞の残渣を除去した。1%(W/V)カルボキシメチルセルロース(CMC)または10%(W/V)セロビオースでセルロースからCBPsを溶出させ、溶出液をSDS-ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動法(SDS-PAGE)で分析した。その結果、CMCおよびセロビオースによる溶出液中から約120キロダルトン(kDa)のタンパク質(CBP1)が検出され、セロビオース溶出液中からはさらに約225kDaのタンパク質(CBP2)も検出された。これらの成績によって、F.Succinogenes S85の菌体保有のCBPsの存在を確認できた。

　F.Succinogenes S85以外のルーメン細菌におけるCBPsの保有状況について検索した。17菌種31菌株のルーメン細菌について、培養液をリゾチームで処理した後、Tween20とSoftes12を加えて溶菌させ、セルロースを添加してCBPsをそれに吸着させた。回収したセルロースを緩衝液Aで洗浄した後、1%CMCまたは5%SDSでセルロースからCBPsを溶出した。溶出液のSDS-PAGE分析において、2菌種ではCMCのみで溶出されるCBPsが、4菌種ではCMCおよびSDSのどちらでも溶出されるCBPsが、3菌種ではSDSのみで溶出されるCBPsが、4菌種はCMCとSDSで異なるCBPsが溶出された。その他の6菌種ではCBPsは検出されなかった。CBPsが検出された菌種のうち、F.succinogenes,F.intestinalis,R.flavefaciens,E.cellulosolvens,M.elsdenii,V.parvulaはセルロースに付着することが確認されていることから、これらの菌のセルロースへの付着には検出されたCBPsが関与していると推定された。また、検出された多くのCBPsの分子量は各菌種で異なっていたが、F.succinogenesの10菌株およびF.intestinalisの1菌株からは共通して約120kDaのタンパク質が検出された。また、R.flavefaciensの4株のいずれからも約30kDaのタンパク質が検出された。Fibrobacterで検出された120kDaのタンパク質は抗CBP1血清を用いるウエスタンイムノブロット解析でCBP1と同一のタンパク質であることが確認された。これらの成績によって、F.succinogenes S85由来のCBP1は属特異的タンパク質であることを明らかにした。

　F.succinogenes S85由来のCBP1とCBP2の精製を行った。該菌の溶菌液中のCBPsをセルロースに結合させた後に回収したセルロースには、菌体由来の膜分画と思われる多量の泥状物質の混入を認めた。しかし、界面活性剤であるSoftes12を含む緩衝液Aでの洗浄によりこれらの夾雑物を除去できた。セルロースから10%(W/V)セロビオースで溶出して得られたCBPs溶液を蒸留水に対して透析することにより水溶液分画(粗CBP1)と不溶性分画(粗CBP2)とに分画できた。得られた粗CBP2を緩衝液Aに溶解し、粗CBP2溶液とした。粗CBP1溶液と粗CBP2溶液に含まれるSoftes12を凝集させるために、これらを飽和硫安で処理した。粗CBP1溶液の処理液は低速遠心分離によって液体からなる下層部とSoftes12を含む固形状の薄膜の表層部とに分画された。CBP1は下層部の溶液中に含まれ、その他の不純物は表層部の膜に存在していた。他方、粗CBP2溶液の飽和硫安処理および低速遠心分離により、CBP2は表層部に分画された。この飽和硫安処理を繰り返すことによりCBP1およびCBP2を精製した。精製したCBP1およびCBP2は-ガラクトシダーゼ、セロビオシダーゼおよびCMCase等の酵素活性を示さなかった。また、精製したCBP1およびCBP2はセルロース粉末に結合したが、デンプン粒子に結合しなかった。

　CBP1遺伝子のクローニングを抗CBP1血清によるイムノスクリーニングとイムノスクリーニングによって得られたクローンをプローブとするジーンウォーキングにより実施した。クローニングされたCBP1遺伝子をプラスミドベクターにサブクローニングしてシークエンスを行った。決定された塩基配列から推定したCBP1タンパク質は、1,054アミノ酸残基からなる分子量118,614のタンパク質で、これは精製CBP1のSDS-PAGE分析により決定された分子量と一致していた。また、この推定アミノ酸配列は、精製CBP1のS.aureus V8プロテナーゼによる消化で得られた2本のペプチド鎖について決定されたアミノ酸配列を含んでいた。さらに、推定アミノ酸配列は繰り返し配列を含み、また、C.cellulolyticumのエンドクルカナーゼ(EGCCDのセルロース結合性ドメインと高い(27.0%の同一性)ホモロジーを示す領域を含んでいた。

　CBP1遺伝子を発現ベクターpRSETAに導入して作出した組換えプラスミドで形質転換した大腸菌は分子量約125,000の融合タンパク質を発現した。この融合タンパク質の精製品は125kDaのタンパク質の他に精製の過程で部分分解により生じたいくつかのタンパク質断片を含んでいた。これらの断片の多くはセルロースへの結合能を有し、抗CBP1血清と反応した。セルロースに結合したタンパク質断片の最小のものは43kDaのタンパク質であった。

　これらの成績は、該菌のCBP1をコードする遺伝子をクローニングし、その塩基配列を決定し、さらにはこの遺伝子を大腸菌で発現することに成功したことを示している。

　本研究はルーメン内主要セルロース分解菌F.succinogenes S85のセルロースへの付着因子を生化学的および遺伝学的レベルで解明し、ルーメン内セルロース分解菌のルーメン内への定着機構の一端を明らかしたものである。