正常人末梢静脈血よりFicol法にて単核球分画を得、L-leucine methyl ester HCl(5mM)で単球、NK細胞を除去。得られたリンパ球分画をヒツジ赤血球を用いたロゼット法を2回繰り返し、ロゼット非形成細胞をB細胞として用いた。得られたB細胞はフローサイトメトリーにてCD14陽性の単球の混入1%以下、OKT3、OKT11陽性のT細胞の混入1%以下、Leu1b陽性のNK細胞の混入無しを確認した。幾つかの実験ではfluorescence-activated cell sorter(FACS)にて、上記方法で得られたB細胞からさらにOKT3、OKT11、CD14、CD16陽性細胞を除去した細胞を用いた。

　B細胞は96穴U底マイクロタイタープレートを用い1穴5x10⁴個でStaphylococcus aureus Cowan I (SA)と共にIL-2とIL-10の存在、非存在下で10〜11日間培養した。2段階培養では1x10⁶個/mlのB細胞を6ml培養試験管内でSAと共にIL-2とIL-10の存在、非存在下で72時間培養、細胞を洗浄した後96穴U底マイクロタイタープレートで1穴5x10⁴個でIL-2とIL-10の存在、非存在下で計10〜11日間培養した。

　B細胞をSAと共にIL-2とIL10の存在、非存在下で72時間培養、0.1%アジ化ソーダ入り2%ヒトAB血清PBSで細胞を洗浄した後、蛍光標識抗体と4℃にて30分反応。細胞を洗浄後1%パラホルムアルデヒドにて固定。解析にはCoulter Immunology社のEPICS Profile及びEPICS XLフローサイトメーターを用いた。

　・プロピディウム.イオダイド(PI)によるDNA染色及び解析

　B細胞をSAと共にIL-2とIL10の存在、非存在下で培養。培養上清を除き、0.1%Triton X-100、0.1%クエン酸Na、および5g/mlプロピディウム.イオダイド入りPBSで4℃にて一晩静置し固定、染色。解析にはCoulter Immunology社のEPICS Profile及びEPICS XLフローサイトメーターを用いた。

　最初にSA⁺IL-2刺激B細胞のIg産生に対するIL-10の影響を検討した。

　Fig.1に示すようにIL-10は単独でも濃度依存性にSA刺激B細胞のIg産生を誘導し得たがその効果はIL-2に比べると微弱なものであった。しかし、IL-2の存在下ではIL-10はSA刺激B細胞のIgM、IgG産生を共に飛躍的に増加させた(Fig.1) 。この相乗効果は抗IL-2レセプター抗体(抗CD25抗体)、もしくは抗IL-10抗体の添加により阻害された。またIL-10は培養72時間までにB細胞のCD25分子発現を増加させた。また、IL-2の作用をほぼ完全に阻害する抗CD25抗体を用いてもIL-10が存在する系ではIg産生を完全に抑えることはできなかった。

FIG.1.IL-10 enhances the production of IgM and IgG of B cells stimulated with SA+IL-2.B cells (5×10⁴/well)were cultured with SA in the presence or absence of IL-2 (0.5 U/ml).Various concentrations of IL-10(0-20 ng/ml)were added where indicated. After 10 days of incubation, the supernatants were harvested 〓〓〓 〓〓〓〓〓〓〓 〓〓〓 〓〓〓 〓〓〓 〓〓〓 〓〓〓〓〓〓〓〓 〓〓 〓〓〓〓〓

　IL-10がSA刺激B細胞の活性のどの段階でIL-2との相乗効果を現わすのかを検討した。

　IL-10はSA⁺IL-2刺激B細胞のIg産生に対し培養開始時や120時間以降に添加するより培養72時間の時点で添加したときに最も強くIg産生誘導作用を示した。一方、IL-2は72時間以降の添加ではわずかなIg産生しか誘導しなかった。IL-2はB細胞の増殖、分化段階ではなく初期活性時に作用すると考えられる。

　2段階の培養方法を用いてB細胞の活性初期、増殖分化段階におけるIL-2とIL-10の共同作用をさらに詳細に検討した。IL-10はB細胞の初期活性段階の条件にかかわらず72時間以降はIL-2より強いIg産生誘導作用を示した。さらにIL-2とIL-10のB細胞のIg産生に対する相乗的増加作用は活性初期ではなく増殖分化段階で発現した。一方、IL-10が初期活性段階で加えられているとCD25分子の発現増加にもかかわらず後半でのB細胞の反応は抑制された(Fig.4)。そしてIL-10の抑制効果はIL-2の添加によって減弱した(Fig.4)。

FIG.4.IL-10 exerts suppressive influences during the initial activation of SA-atimulated B cells.B cells(1×10⁶/ml)were preincubated in a 6-ml tube with SA in the presence or absence of IL-2(0.5 U/ml)and IL-10(10ng/ml)for 72h.After the first incubation,the cells were washed and racultured in microtiter plates(5×10⁴viable B cells/well)in the presence or absence of IL-2(0.5 U/ml)and IL-10(10 ng/ml).After a total length of 10 days of incubation,the supernatants were harvested and assayed for IgM contents by ELISA.Statistical significance was evaluated by Wilcoxon signed rank test.

　IL-10はSA活性化B細胞の生存率を低下させた。PIによるDNA染色では、IL-10の添加によりDNAが断片化した細胞が増加しておりこれはアポトーシスを起こしている細胞の増加を示す。対照的にIL-2の添加ではアポトーシスは減少し、さらにIL-10によるアポトーシスもIL-2により抑制された。これらの結果よりIL-10はSA刺激B細胞のアポトーシスを誘導し、IL-2はIL-10の誘導するアポトーシスから回避させることが示唆される。同時に観察したBcl-2蛋白の発現は、アポトーシス量と逆相関を示した。

　経時的な観察では、活性初期よりIL-10を添加したB細胞は72時間以降明確にアポトーシスの増加を示した。72時間までのIL-10の影響がIg産生細胞への分化が終了する120時間での細胞の生存に及ぶかどうかを2段階の培養を用いて確認した。最初にIL-10を添加すると後半加えるサイトカインに関係なく120時間でのアポトーシスが増加し、最初にIL-2を加えるとアポトーシスは減少した。また、IL-10は後半の添加ではIL-2と同程度にアポトーシスを抑制した。

　さらに詳細に検討すると、培養初期に添加したIL-10は72時間から120時間のIgM産生は増加させたが120時間から144時間のIgM産生を抑制した。さらに120時間から144時間のIgM産生は120時間でのアポトーシスの割合および144時間での細胞の生存率と有為な相関を示した(p＝0.021およびp＝0.014,simple linear regression test)(Table6)。また、IgGも同様の傾向を示し、この結果がIL-10がクラススイッチを誘導した結果ではないものであると考えられる。

FIG.6 IL-10promotes the apoptosis of SA-activated Bcells.B cells(5×10⁴/well)were cultured with SA in the presence or absence of IL-2(0.5U/ml)and IL-10(10ng/ml).After 72h of incubation,the number of B cells undergoing apoptosis was measured by staining with propidium iodide,followed by analysis by flow cytometry as described in Materials and Methods.Percentage of apoptotic B cells:Nil,30.8%;IL-10,46.0%;IL-2,19.4%;IL-2+IL-10,20.7%.

TABLE 6 The influences of IL-10 during the initial activation of SA stimulated B cells on the IgM production,the progression of apopcosis,and the viable cell recovery