B.brauniiの新株の野外からの分離を試み、東京大学構内、山梨県山中湖から1株ずつ、山梨県河口湖から2株を得ることができ、それぞれYayoi、Yamanaka、Kawaguchi-1、Kawaguchi-2株と命名した。これらの株の生産する炭化水素の含量、組成につき分析を行った。炭化水素含量は、Yayoi株で凍結乾燥藻体重量の33%と最も高く、Kawaguchi-1株(18.8%)、Yamanaka株(16%)、Kawaguchi-2株(9.7%)の順であった。GCおよびGC-EIMSによる炭化水素組成分析の結果、Yamanaka株はC₂₇H₅₂、C₂₉H₅₆のalkadieneを主成分とするA品種であったが、残りの3株は、いずれもbotryococcene類を生産するB品種であることがわかった。Yayoi株の炭化水素はC₃₄H₅₈の、また、Kawaguchi-1、Kawaguchi-2株ではC₃₂H₅₄のbotryococcene類が主成分であった。さらに、後2株にはsqualeneの類縁体も他株に比べ多く含まれていた。

　Yayoi株の生産する炭化水素を、順相、逆相のカラムクロマトグラフィーおよびHPLCで精製し、10成分を単離することができた。それらにつき、GC-EIMS、¹Hおよび¹³CNMRによる同定を試みた。その結果、既知化合物であるC₃₀、C₃₁(showacene、isoshowacene)、C₃₂、C₃₄ botryococcene類、meijicocceneおよびtetramethylsqualeneの他に、新規なbotryococcene類(3成分)の存在を確認できた。これらの新規botryococcene類につき、各種2次元NMRにより構造決定を行い、1、2、3の平面構造を得た。

　Yayoi株を2%の炭酸ガスを含む空気を通気して培養し、藻体の増殖と炭化水素生産との関係を調べた。増殖速度は3日から6日目が最大で、倍加時間は3.5日であった。炭化水素含量は、3日目に凍結乾燥藻体重量の40.5%と最大値を示した。培養期間全体を通じて、C₃₄botryococceneが主成分であったが、初期から中期にかけて炭素数の少ないbotryococcene類の割合が増加した。また、植え継ぎ直後および培養期間の後期に、meijicocceneおよびtetramethylsqualeneが検出された。これらのことから、Yayoi株においてもBerkeley株などの既存のB品種と同様に、炭化水素は増殖の活発な時に生産され、炭素数の少ないbotryococceneが順次メチル化されていくものと考えられた。

　Berkeley株の凍結乾燥藻体をアセトンに浸漬し、細胞間マトリクスに存在する脂溶性成分を抽出した。抽出物から順相、逆相のカラムクロマトグラフィーおよびHPLCにより、新規カロテノイドであるbotryoxanthin A(4)を単離した。本物質はヘキサン中で479、450nmに極大吸収を示し、,-carotene様の部分構造を持つことが示唆された。高分解能FABMS、各種NMRデータから分子式をC₇₄H₁₁₂O₂と決定した。¹H、¹³C NMR、COSY45、HMQC、HMBCスペクトルから、本物質は、,-caroteneとtetramethylsqualeneを部分構造として持ち、,-caroteneの4位の炭素とtetramethylsqualeneの10"位および11"位の炭素がアセタールを介して結合していることが明らかになった。また、共役二重結合部のプロトン間の結合定数の値、およびPSNOESYスペクトルの解析により、,-carotene部分の共役二重結合はall-transであると決定された。

Kawaguchi-1株からのbotryoxanthinBおよび-botryoxanthin Aの単離と構造決定

　Kawaguchi-1株の凍結乾燥藻体から、細胞間マトリクスに存在するカロテノイド類を抽出し、ODSカラムクロマトグラフィー、順相および逆相のHPLCによりbotryoxanthin B(5)、botryoxanthin Aおよび-botryoxanthin A(6)を単離した。

　Botryoxanthin Bは、ヘキサン中で457nmに極大吸収を示し、-echinenone様の部分構造を持つことが示唆された。高分解能FABMS、各種NMRデータより本物質の分子式はC₇₄H₁₁₀O₃と決定された。各種2次元NMRスペクトルをbotryoxanthin Aと比較しながら解析したところ、本物質はbotryoxanthin Aの4’位のメチレン炭素が、カルボニル炭素に置き換わった構造を持つことが明らかになった。

　-Botryoxanthin Aは、ヘキサン中で473、445、421nmに極大吸収を示し、-carotene様の部分構造を持つことが示唆された。高分解能FABMS、各種NMRデータから本物質の分子式をC₇₄H₁₁₂O₂と決定した。¹H、¹³C NMR、各種2次NMRスペクトルの検討の結果、tetramethylsqualeneとアセタール結合をしていない側のionone環が、タイプであることが明らかになり、6の平面構造を得ることができた。

　Kawaguchi-1株の細胞間マトリクスから、ODSクロマトグラフィー、各種HPLCにより、赤色カロテノイドであるbraunixanthin-1(7)および2(8)を単離した。Braunixanthin-2は、ヘキサン中で460nmに極大吸収を示し、-echinenone様の部分構造を持つことが示唆された。高分解能FABMS、各種NMRデータより本物質の分子式はC₁₁₃H₁₈₂O₈と決定された。各種2次元NMRから、braunixanthin-2は3位に酸素原子の結合した-echinenone、10"、11"、14"、15"位に酸素の結合したtetramethylsqualene、および長いメチレン鎖の中に、酸素が結合した2つの隣り合った炭素を含むalkylphenolを、部分構造として持つことが明らかになった。メチレン鎖中に於けるこれらの酸素が結合した炭素の位置は、NMRデータからは決定できなかったが、本藻種のA品種から同様の構造を含むalkylphenol類が単離、構造決定されており、それらでは酸素原子はメチレン鎖の9および10に存在することから、braunixanthin-2中のalkylphenolにおいても同様の位置に存在すると推定した。HMBCスペクトルから、長鎖alkylphenol中のこれらの隣り合った炭素が、それぞれ-echinenoneの3位、tetrametylsqualeneの10"位の炭素とエーテル結合をしていることが示唆された。Tetramethylsqualeneに結合している酸素のうち、15"位の酸素は水酸基として存在し、11"位と14"位の炭素はエーテルを介して結合しているものと考えられた。しかしながら、長鎖alkylpheno1の9および10の帰属ができないため、braunixanthin-2の推定構造は(8a)および(8b)の2通りの可能性が考えられた。

　Braunixanthin-1の分子式は高分解能FABMS、各種NMRデータよりC₁₁₁H₁₇₈O₈と決定された。可視部吸収、各種NMRデータはbraunixanthin-2と酷似していることから、braunixanthin-1はbraunixanthin-2よりalkylphenol部のメチレン鎖が2つ分短い構造(7a,7b)を持つと考えられた。

　以上、日本国内から、既存のB品種に比べて、遜色のない炭化水素生産能を持つ新株を分離し、その特質を明らかにすることができた、また、tetramethylsqualeneを分子内に有する新規カロテノイド、botryoxanthin類およびbraunixanthin類の単離、構造決定を行った。これらの物質の存在は、本藻種のB品種による炭化水素生産と、藻体の色調が密接な関係にあることを示唆するばかりでなく、本藻種におけるsqualene関連物質の存在が多岐に亘ることを示している。したがってB.brauniiはエネルギー資源としてだけでなく、ファインケミカル原料としての利用も考えられる.

　B.brauniiの新株の野外からの分離を試み、東京大学構内、山中湖から1株ずつ、河口湖から2株を得、それぞれYayoi、Yamanaka、Kawaguchi-1、Kawaguchi-2株と命名した。これらの炭化水素含量は、Yayoi株で凍結乾燥藻体重量の33%と最も高く、Kawaguchi-1株(18.8%)、Yamanaka株(16%)、Kawaguchi-2株(9.7%)の順で、Yamanaka株のみがalkadieneを生産するA品種で、他はbotryococcene類を生産するB品種であった。

　Yayoi株から10成分の炭化水素を単離し、GC-EIMS、¹Hおよび¹³C NMRによる同定を試みたところ、既知の炭化水素7成分の他に、新規なbotryococcene類(3成分)の存在を確認できた。これらにつき各種2次元NMRにより構造決定を行い、1、2、3の平面構造を得た。

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　Yayoi株における増殖と炭化水素生産との関係を調べたところ、増殖速度は3日から6日目が最大で、炭化水素含量も同時期に最大値を示した。培養期間を通じて、C₃₄ botryococceneが主成分であったが、初期から中期にかけて炭素数の少ないbotryococcene類の割合が増加した。これらのことから、Yayoi株でも既知のB品種と同様に、炭化水素は増殖の活発な時に生産され、炭素数の少ないbotryococceneが順次メチル化されるものと考えられた。

　Berkeley株の細胞間マトリクスから、新規カロテノイドであるbotryoxanthin A(4)を単離した。HRFABMS、UV-VIS,各種2次元NMRスペクトルデータから、本物質の分子式はC₇₄H₁₁₂O₂で、all-trans--caroteneの4位の炭素とtetramethylsqualeneの10"位および11"位の炭素がアセタールを介して結合している構造を持つことが明らかになった。

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Kawaguchi-1株からのbotryoxanthin Bおよび-botryoxanthin Aの単離と構造決定

　Kawaguchi-1株の細胞間マトリクスから、botryoxanthin B(5)、4および-botryoxanthin A(6)を単離した。HRFABMS、UV-VIS、各種2次元NMRスペクトルデータから、5および6は4のall-trans--carotene様部分構造が、それぞれall-trans--echinenone、all-trans--caroteneに置換した構造であることがわかった。

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　Kawaguchi-1株の細胞間マトリクスから、新規カロテノイドのbraunixanthin-1(7)および2(8)を単離した。8は、UV-VIS、HRFABMS、各種2次元NMRスペクトルデータより、その分子式はC₁₁₃H₁₈₂O₈で、2つの酸素が隣接して結合する長いメチレン鎖を持つalkylphenolが、-echinenoneの3位およびtetramethylsqualeneの10"位とエーテル結合していることが明らかになった。Tetramethylsqualene様部分構造の15"位には水酸基が存在し、11"位と14"位はエーテルを介して結合していた。alkylphenol中の酸素の結合位置を9および10と仮定したが、その帰属ができないため、8の推定構造は(8a)および(8b)の2通りの可能性が考えられた。

　7の分子式はC₁₁₁H₁₇₈O₈で、UV-VIS、各種NMRスペクトルデータは8と酷似していることから、8よりalkylphenol部のメチレン鎖が2つ短い構造(7a,7b)を持つと考えられた。7章は総合考察である。

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　以上、日本国内から、既知のB品種と遜色のない炭化水素生産能を持つ新株を分離し、その特質を明らかした。また、tetramethylsqualeneを分子内に有する新規カロテノイド、botryoxanthin類およびbraunixanthin類の単離、構造決定を行った。これらの結果は、エネルギー資源およびファインケミカル原料としての本藻種の有効利用に関する基礎的知見を提供したもので、学術上のみならず応用上も価値が高い。よって審査員一同は、本論文が博士(農学)の学位論文として価値あるものと認めた。