まず、画像解析による懸濁液中の細胞量の定量化手法を開発した。懸濁液のマクロ画像より抽出した定量化指標として、懸濁液画像中の細胞塊に対応する画素の総数、および、懸濁液画像のすべて画素のB成分(RGBカラー画像中のB成分)の値の合計値により、懸濁液のpacked cell volume(PCV)を推定することができた。そして、次に、懸濁液の不定胚形成能力と増殖速度との関係を調べるために、画像解析により推定したPCVから懸濁培養細胞の比増殖速度を求め、単位懸濁液中に含まれる不定胚になる能力を持った細胞塊(proembryogenic mass,以下PEM)の数(以下PEM density)として表現した実際の不定胚形成能力との関係を調べた。懸濁液のマクロ画像は、懸濁液が培養器に入っている状態で、容器の底面から、蛍光灯による透過光照明下のもとカラービデオカメラで撮影した(Fig.2)。Fig.3に単一セルラインの培養細胞の比増殖速度とPEM densityとの関係を示す。培養期間の増加すなわち継代回数の増加に伴った不定胚形成能力の低下に伴い、比増殖速度は増加した。懸濁液中の細胞がembryogenicな状態からnon-embryogenicな状態に変化していく過程で、懸濁液全体としての体積もしくは生体重の増加が起こり、これが今回の比増殖速度の変化に表れたものと考えられた。この結果は、懸濁液の増殖速度が単一セルラインにおける不定胚形成能力の変化を反映している可能性があることを示すものである。

　懸濁液のマクロ画像のテクスチャ特徴量を利用した不定胚形成能力の評価法を開発するため、懸濁液の不定胚形成能力とそのマクロ画像より抽出したテクスチャ特徴量との対応を調べた。テクスチャ解析には濃度共起行列法を用いた。不定胚形成能力の高い細胞懸濁液は、懸濁液中に肉眼で確認できる程度の比較的大きい細胞塊が多く含まれ、不定胚形成能力の低い懸濁液は細かい細胞塊からなるという傾向が見られた。そして、この懸濁液中の細胞塊の大きさの分布の違いは、テクスチャ特徴量の値の差に現れた。Fig.4に、計算したテクスチャ特徴量とPEM densityとして表現した懸濁液の不定胚形成能力の関係を示す。不定胚形成能力の高い懸濁液では、テクスチャ特徴量Entropyが大きくなった。さらに、実際に誘導された不定胚数とテクスチャ特徴量の関係においても、多くの不定胚を誘導できた懸濁液でテクスチャ特徴量Entropyが高くなった(Fig.5)。すなわち、テクスチャ特徴量Entropyの大きい懸濁液はより多くの不定胚を誘導しうることが示唆された。以上により、細胞懸濁液のマクロ画像のテクスチャ解析による不定胚形成能力評価の可能性が示唆された。

　不定胚の形状とその生育との関係を調べるために、大きさの揃った不定胚を顕微鏡下で写真撮影した後、発芽用培地に移植して、その後の生育を28日間観察した。不定胚の形状は、その子葉の形状および不定胚の曲がりやこぶなどの異常の有無により分類した。合計195の不定胚について調べた。その結果、試験した不定胚の形状は多様であり、異なった形状の不定胚においては生育パターンが異なった(Table1)。試験した不定胚のうち70%が枯れることなく生長した。そのうち約半分が本葉を持った幼植物体へと生育したが、実生苗と同じように正常な本葉を持った幼植物体に生育したものは、全体の10%に満たず、それらのほとんどは、子葉が2つにはっきりと分かれ、曲がりやこぶなどの異常がないものであった。これらのことは不定胚の形状を不定胚選別の指標として利用することの妥当性を示唆している。

Table1 Relationship between type of cotyledon of somatic embryos and their growth.

　Fig.5に開発した装置の概要図を示す(SOMESと命名)。この装置は、細いチューブの中をキャリアフローにのって移動していく不定胚の画像を画像取り込み用セル(以下、Imaging cell)において獲得し、画像解析の結果から、流路切り替えによる選別動作を行うものである。SOMESでは、Kurataらによる細線化によって得られた骨格画像(以下skeleton)の形状を用いた不定胚評価アルゴリズム(1993)を採用した。この場合、形状に関する実験から得られた結果から、子葉が深く2つに分かれ、曲がりやこぶなどの異常のないものを正常胚とし、選別対象とした。この装置により実際に不定胚選別実験を行ったところ、不定胚の正常率(不定胚の集団における正常なものの比率)を18%から56%の約3倍に向上させることができたが、正常なものを正常とみなす判断率は40%と低かった。誤った判断の主な原因は、不定胚がimaging cell中で回転してしまい、評価しにくい方向からの画像を獲得してしまったことであった。すなわち、1方向からの画像だけでは不定胚の評価には不十分であった。そこで、imaging cellに鏡を取り付け、90°の角度をなす2方向からの画像を同時に獲得できるように改良し、それらの画像のskeletonの組み合わせにより、不定胚を評価することを試みた。その結果、skeletonの組み合わせがYIパターン(一方のskeletonはY字型でもう一方がI字型)であることが、正常な不定胚の判断基準として適当であった。この指標を使って行った選別試験では1方向のみの画像を利用した場合と比較して判断の正確が向上した。