10および30℃馴化コイの普通筋から常法によりミオシンを精製した。このミオシンにウサギ速筋F-アクチンを加え、種々の温度でアクチン活性化ミオシンMg²⁺-ATPase活性を測定してアウレニウス・プロットを行い、活性化エネルギーを算定した。その結果、10および30℃馴化コイのミオシンでそれぞれ約110および130kcal/molと、10℃馴化コイの活性発現部位がより柔軟な構造をもつことが示唆された。そこでミオシンを加熱したときに一次反応的に減少するCa²⁺-ATPase活性を指標に、両ミオシンの熱安定性を調べた。その結果、10および30℃馴化コイのミオシンの加熱温度30℃における変性速度恒数はそれぞれ3.0および1.8x10^-4s^-1と、10℃馴化コイのミオシンが30℃馴化コイのそれより1.7倍熱安定性が低いことが示された。

　ミオシン分子はプロテアーゼ限定分解により、N末端側のATP分解の触媒部位およびアクチンとの結合部位を含む頭部サブフラグメント-1(S1)と、C末端側の-らせんからなる尾部ロッドに分かれる。ロッドはプロテアーゼ限定分解でさらに、N末端側のサブフラグメント-2(S2)と、C末端側のL-メロミオシン(LMM)に分かれる。そこで、これら2つのプロテアーゼ切断領域の消化性につき、10および30℃馴化コイのミオシンを対象に調べた。まず、0.12MNaCl中のミオシンに、ミオシンに対する重量比で1/120の-キモトリプシンを加えて10℃で消化したところ、10および30℃馴化コイのものともS1およびロッドに一次反応的に分解したが、その速度定数はそれぞれ4.2および6.1x10^-4s^-1と、むしろ10℃馴化コイのミオシンの方がプロテアーゼ消化に対しては安定であった。さらに常法により高純度に精製したロッドを0.5MKClに溶解し、ロッドに対する重量比1/100の-キモトリプシンを加えて10℃で消化したところ、両ミオシンともS2およびLMMに分解し、その速度定数はいずれも2x10^-4s^-1と算定された。

　まず、30℃馴化コイのS1につき、トリプシン限定分解を行った。SDSゲル電気泳動分析の結果、N末端側からの3つの25、50および20kDaフラグメントが検出された。一方、同条件下で10℃馴化コイのS1を処理したところ、20kDaフラグメントの代わりに23kDaフラグメントが認められた。そこで、各バンドにつきN末端アミノ酸配列を分析した結果、25kDaフラグメントは両馴化コイのものともN末端アミノ酸が検出されず、修飾されていることが示唆された。次に、50kDaフラグメントにおいては、10℃馴化コイではKAEAVPGKMQGSLE、他方30℃馴化コイではKPEPVPGKMQSSLEDQIVAと、両S1間で明らかに一次構造が異なることが示された。さらに、30℃馴化コイS1の20kDaフラグメントではKKGLDNETVSAKFの配列が得られた。一方、10℃馴化コイS1の23kDaフラグメントのN末端アミノ酸配列はKPKPAQQAEPと、切断部位が50kDaフラグメントのC末端領域に入り込んでいることが示唆された。

　次に、両馴化コイのロッドにつき、N末端アミノ酸配列分析を試みたが、同定することができなかった。そこで、常法によりLMMを精製してSDSゲル電気泳動分析に付したところ、10℃馴化コイからは分子量69、66および62kDaの3本のバンドが、一方、30℃馴化コイからは74、69、66および62kDaの4本のバンドが得られた。各バンドのN末端アミノ酸配列分析を行ったところ、10℃馴化コイの69および66kDa成分はRAKYETDAIQRTEELEEの配列を示した。なお、62kDaのバンドからはAANLDKKQRNLDKVLAの配列が得られ、既報の他種ミオシンの一次構造との比較から、この配列のN末端は先の69および66kDa成分より約70残基C末端側に位置することが推察された。一方、30℃馴化コイの4本のバンドはいずれもRTKYETDAIQRTEELEEで、両ミオシンはロッド部分の一次構造も異なることが示された。

　さらに、10℃馴化コイのミオシンを抗原にマウスを免疫し、モノクローナル抗体の調製を試みた。その結果、S1に対する抗体を産生する35A11、41C2および41D12の細胞株を樹立することができた。S1のトリプシン限定分解物に対するイムノブロッティング分析の結果、35A11および41C2株はそれぞれS1の25kDaおよび50kDaフラグメントを認識することが明らかとなったが、30℃馴化コイS1のトリプシン分解物との反応性の差異はみられなかった。一方、41D12株の産生する抗体は10℃馴化コイのS1から特異的に得られるC末端側の23kDaフラグメントに特に強く反応したが、25kDaおよび50kDaフラグメントとの反応性もみられた。

　次に、30℃馴化コイのロッドを抗原としてモノクローナル抗体の調製を試みた。樹立された37G3細胞株の産生する抗体の特異性をイムノブロッティング法で調べたところ、30℃馴化コイのロッドおよびLMMにある程度の特異性を示したものの、10℃馴化コイ由来のものとの差は大きくなかった。

　まず、前述のように調製した10および30℃馴化コイのミオシンをpH8.0の0.6M KClに溶解し、示差走査熱量計(DSC)に昇温速度2.5℃/分の条件下で付した。その結果、タンパク質のunfoldingに伴う吸熱反応の転移温度(Tm)は、10℃馴化コイのミオシンでは32.8、34.9および47.4℃に観察された。各Tmのカロリメトリー・エンタルピー(△Hcal)はそれぞれ73、228および80kcal/molで、34.9℃の吸熱ピークが最も高かった。一方、30℃馴化ミオシンのTmは35.9、39.7および49.1℃と測定され、△Hcalはそれぞれ248、211および91kcal/molで、39.7℃の吸熱ピークが最高であった。そこで次にロッドについても同様に分析したところ、10℃馴化コイのTmは32.9、33.4および44.1℃と、△Hcalはそれぞれ86、146および69kcal/molと測定された。他方、30℃馴化コイのTmは34.5、39.7および46.7℃と、△Hcalはそれぞれ95、115および159kcal/molと測定された。いずれのロッドも中間温度の吸熱ピークが最も高かった。したがって、ミオシンで観察されたTmはロッドのそれに由来すること、最大吸熱ピーク同士を比較すると10℃馴化コイのロッドは30℃馴化コイのそれより約6℃も低いこと、が明らかとなった。

　次に、20℃における円二色性(CD)の測定からロッドの222nmにおける分子楕円率を求めて-らせん含量を調べたところ、10および30℃馴化コイのものとも70%以上の値が得られた。さらに、種々の温度で222nmにおける分子楕円率を調べ、単位上昇温度当たりの-らせんの崩壊度を算出した。その結果、両馴化コイのロッドとも極大値を示す温度は上述のTmとよく類似し、ロッドのunfoldingが-らせんの崩壊によるものであることが明らかになった。

　さらに両馴化コイのロッドからLMMを調製し、DSCおよびCD分析に付した。その結果、10℃馴化コイLMMのTmは32.5および39.5℃と、△Hcalはそれぞれ269および52kcal/molと測定された。一方、30℃馴化コイLMMのTmは39.2および47.3℃と、△Hcalはそれぞれ231および39kcal/molと測定された。いずれのLMMも低温側の吸熱ピークが著しく高かった。したがって、LMMの場合でも最大吸熱ピークのTmを比較すると10℃馴化コイのものの方が約7℃低く、熱安定性に劣ることが明らかとなった。CD測定でもロッドの場合と同様に、DSCの吸熱ピークは-らせんの崩壊に基づくことが明らかとなった。

　以上本研究により、コイは10および30℃馴化に伴って頭部S1および尾部ロッドとも一次構造の異なる普通筋ミオシン・アイソフォームを発現することが示された。さらに両ミオシン・アイソフォームのプロテアーゼ感受性には大きな差はみられないものの、頭部S1ではCa²⁺-ATPaseを指標として、尾部ロッドではDSC測定によって、いずれも10℃馴化コイの方で30℃馴化コイより熱安定性が劣ることが明らかにされた。これらの成果は食品生化学上のみならず、比較生化学上にも資するところが大きいものと考えられる。