Contact inhibition theoryは培養正常細胞が高密度培養条件下で接触すると増殖を停止することから細胞接触による増殖抑制機構が存在すると想定された仮説である。この仮説の生体内における意義は、細胞の過剰増殖が抑制されることによって臓器恒常性が維持される点にあると推定されているが、その機序については殆どが不明である。

　筆者の研究は共同研究者の藤原らが接触阻止現象の生体内における意義を肝再生過程において検討したことに端を発する。藤原らは、培養肝細胞を用いて肝細胞膜(ratliver plasma membrane:以下PM)による増殖抑制の作用はS期から6時間以前のG₁期に見られたと報告している。筆者の研究はこの作用機序を解明することから、肝細胞のG₁期早期増殖機構を知ることを目的に開始された。

　従来、肝細胞増殖に関する研究ではラットなど小動物から単離した初代培養肝細胞が汎用されてきた。しかし、この細胞は特に増殖の点で他の細胞とは異なる特殊な細胞系と考えられている。即ち、初代培養肝細胞は単離直後は殆ど増殖能がない。十分なDNA合成を生じさせるためには、一定時間予備培養した上で増殖因子を添加し、実験を開始する。通常、この時間として24時間程度が汎用されるが、この理由は不明であった。細胞単離に際して用いられるコラゲナーゼによる細胞障害からの回復に要する時間とする考えが一般的であったが、明らかな証拠はなかった。筆者は細胞単離により生体内の細胞接触を解除された静止期(G₀期)の肝細胞が、何らかの原因によりコンピテント状態、即ち増殖因子へ反応しうる状態に達するのに要する時間であり、肝細胞膜はこの過程を抑制するものと想定した。コンピテント状態をきたす要因として、他の細胞系でそのような作用を有するとされているprotein kinase C.Aなどの細胞内情報伝達系の関与に注目し、以下の検討を行なった。

　ラット初代培養肝細胞の培養24時間目にepidermal growth factor(EGF)とinsulinまたはPKC活性化作用のある12-o-tetradecanoyl-phorbor-13-acetate(以下TPA)を添加し、48時間目のDNA合成を比較したところ、肝細胞のDNA合成はEGFとinsulinによって十分な誘導されたのに対し、TPA添加では無添加の対照と有意差はなかった。EGFとinsulinがS期へのプログレッション作用を有するのに対し、PKCを活性化してもその作用は生じないと考えられた。次に、培養開始直後にラット肝より精製したPM、vasopressin(VP)、TPAを添加し、これらを6または24時間目に洗浄して除いた後に、EGFとinsulinを添加し、各々24時間後のDNA合成を測定した。EGF及びinsulinを6時間目に添加した際のDNA合成は、これらを24時間目に添加した場合の7%にすぎなかった。一方、VPまたはTPAにより前処置しておくと、このDNA合成は有意に上昇し、24時間目にEGF,insulin添加した場合のDNA合成の30%にまで達した。しかし、この上昇はPMを添加しておくと全く認められなかった。VPまたはTPA添加を培養4から24時間目までとしてもほぼ同様の結果が得られた。PKCを活性化しておくと、培養開始直後においてもEGF,insulinにより著明なDNA合成の誘導が見られたことから、PKCを介する細胞内情報伝達が肝細胞のコンピテント状態への移行を促進したものと考えられ、PMはこの過程を抑制したと推定された。一方、protein kinase A,Gについても同様の検討を行なったが、PKCのようなコンピテント作用は認められなかった。各種protein kinase inhibitorを用いた実験からも、肝細胞のG₁期早期におけるコンピテント状態成立を促進する因子としては、PKCが最も重要な情報伝達系であると考えられた。これらの結果から、細胞接触による肝細胞増殖抑制の機序は、PMに存在する増殖抑制因子がPKC活性化以降の情報伝達を抑制することにより、肝細胞がコンピテント状態に向かうことが阻止され、その結果、細胞は静止期に留まるものと考えられた。

　一方筆者はこれらの一連の実験を進めるうちに、ラットPMには培養肝細胞の増殖を促進する因子も含まれることを偶然見出した。発見の端緒となったのは、PMに存在する増殖抑制因子の細胞周期から見た作用点を知るためにPMの添加を時期を様々に変えてみた実験であった。その結果、PMをG₁期中期から後期と考えられる時期に添加すると培養開始直後に添加した場合と逆に、EGF,insulinにより誘導されたDNA合成が有意に増強されることが明らかになった。

　このPMに培養肝細胞の増殖促進活性が存在するとの観察は筆者らの報告が初めてである。この活性は熱、酸、各種プロテアーゼ処理で失活、または減弱することより、蛋白性の因子によるものと考えられた。PMは単独ではDNA合成を誘導せず、増殖促進作用は、EGFやhepatocyt’e growth factor(HGF)などのmitogenとの共存により発揮されることから、この因子はcomitogenと考えられた。またこの活性は各種臓器由来の株細胞を用いて検討した結果、肝細胞特異的であることも判明した。本因子はPMを細菌性コラゲナーゼで処理することにより可溶化され、その活性部位は分子量25K以下の分画に含まれるものと考えられた。

　肝細胞のcomitogenについては多くの報告があるが細胞膜に存在する因子の報告はない。また、この因子の細胞周期における作用点はG₁期の中期または後期に作用すると推定され、同様な作用点を持つ因子の報告は極めて稀であり、細胞増殖の研究においても重要な因子と考えられる。

　以上は初代培養肝細胞を用いて、PMに存在する増殖抑制因子及び増殖促進因子について検討した結果である。しかし、両者共に正常のラット肝に存在する生理的因子であるため、これらの生体内における意義が注目される。そこで筆者は、ラットに70%部分肝切除を行ない、術後経時的に摘出した肝よりPMを精製し、増殖促進及び抑制活性の推移を検討した。

　PMの増殖促進活性は肝切除術後直後より低下し始め、16時間目には殆ど消失たが、31時間目には正常肝PMと同等の活性に回復した。この結果から、PMの増殖促進因子は生体内においても肝細胞増殖に関連する因子であり、肝再生過程で消費された可能性が示唆された。一方、増殖抑制活性は部分肝切除術後31時間目までほぼ一定であった。この抑制活性が正常肝と70%部分肝切除後12時間目の肝との間に差が無かったことは既に共同研究者の藤原らが報告しているが、筆者の検討はより詳細な経時的推移を観察したものである。PMの増殖抑制活性は肝再生過程では変化せず、藤原らの考察と同様に、この抑制因子活性の変化が肝再生の引き金にはなりえないものと考えられた。

　近年、肝細胞の増殖調節機構についてはHGFやtransforming growth factor 、などの液性因子の作用が注目されている。しかし、筆者らは以上の結果を基に、肝細胞膜による肝細胞増殖調節機構が存在するとの仮説を提唱しているので、その概要について言及する。

　血中には多くのコンピテント因子が存在しているが、正常肝の肝細胞は細胞接着が強固で、肝細胞膜中の増殖抑制因子の作用を受けるため、静止期(G₀期)に保たれている。しかし、肝障害等により、肝細胞間隙が開大すると肝細胞は肝細胞膜中の増殖抑制因子の作用を免がれ、コンピテント因子によりG₁期に移行する。コンピテント状態に到達した肝細胞はHGFなどのmitogenによりS期、更にM期へと進展する。この際、肝細胞膜中の増殖促進因子はmitogenの作用を増強して、肝細胞の増殖を促進する。肝細胞が分裂を終え、細胞接着を回復すると、細胞膜中の増殖抑制因子の作用が再び発現し、静止期に維持される。

　これらの肝細胞膜の増殖調節因子を同定し、以上の仮説を証明していくことが今後の課題である。

　本研究は肝再生過程の機序について肝細胞膜による肝細胞増殖の観点から検討したもので、ラットを用いたin vivo及びin vitroの実験結果より、下記の結果を得ている。

　1.接触阻止現象は細胞膜に含まれる膜蛋白によって引き起こされる細胞の増殖抑制と考えられている。肝細胞においても同様の現象が報告されているが、その機序はこれまで不明であった。しかし、ラット培養肝細胞を用いた筆者の検討により、この現象の一因はプロテインキナーゼC活性化によるG₁期早期での肝細胞増殖促進(コンピテント状態成立)の抑制によるものと推定された。

　2.プロテインキナーゼA及びGを介する細胞内情報伝達系はプロテインキナーゼCのような積極的な肝細胞増殖促進作用は有さないもののG₁期早期肝細胞増殖において一定の役割を果たす可能性が示唆された。

　3.G₁期早期肝細胞増殖においてプロテインキナーゼAを活性化するとプロテインキナーゼC活性化による増殖促進作用が顕著に抑制され、両情報伝達系との間に相互作用、いわゆるCross talkの存在が示唆された。

　4.肝細胞膜にはG₁期後期において培養肝細胞の増殖を促進する因子も存在する。この因子は熱及び酸に不安定な膜蛋白と推定され、細菌性コラゲナーゼにより、分子量25K以下の活性部位が遊離するものと推定された。また、種々の臓器由来の培養細胞を用いた培養実験により、本因子は肝細胞特異的に働く増殖促進因子であることが示唆された。

　5.これらの肝細胞膜に存在する培養肝細胞増殖関連因子の生体内における意義をラット70%部分肝切除後肝再生過程において検討した。その結果、肝細胞膜の増殖抑制活性は正常肝と差が無かったのに対して、増殖促進活性は切除後6時間頃から低下し、16時間目には消失した後、31時間目に正常肝細胞膜と同じ活性にまで回復した。以上の結果から、肝細胞膜に存在する培養肝細胞増殖促進因子は、生体内の肝細胞増殖においても関与する可能性が示唆された。

　以上、本論文はラット初代培養肝細胞を用いた培養実験及びin vivoの検討より、肝細胞膜の肝細胞増殖における役割を明らかにしようとしたものである。従来、肝細胞膜については接触阻止現象のみが注目されており、またその機序についても不明であった。本研究により、肝細胞における接触阻止現象の原因が、プロテインキナーゼC活性化を介する細胞内情報伝達の抑制であることが明らかになった。更に、本論文の独創的な点は肝細胞膜に肝細胞増殖促進因子が存在することを示した点である。この因子はG₁期後期に作用するものと推定され、今後更に研究の発展が望まれる。近年、肝再生の機序については、増殖促進、抑制作用とも液性因子によって調節されているとの説が主流であるが、本研究成果により改めて細胞接触の肝細胞増殖における重要性が示された。本論文内容の肝再生研究への貢献は多大であり、学位の授与に値するものと考えられる。