自律神経終末と多数のシナプスを作ると同時に、心筋細胞にも接している介在細胞という特異的な非筋細胞はこれまでに硬骨魚のドジヨウとマツバガレイの心臓洞房結節組織にしか認められていない。そこで本実験の第1部ではフナを含め20種類計89匹の硬骨魚類のほか、円口類(ムラサキヌタウナギ)、両棲類(イモリとウシガエル)および爬虫類(カナヘビとミドリガメ)の心臓の洞房結節組織を電顕的に観察し、介在細胞の種間分布を調べた。また、ドジヨウにおいては両側性迷切後、介在細胞に接している軸索終末の大部分が変性することは知られているが、しかし、迷切後の神経再生過程についてはまだ明らかにされていないため、本実験の第2部では、78匹のドジョウを使用した迷切実験を行い、迷切後の神経の変性および再生過程における介在細胞への神経支配の変動を明らかにしようと試みた。

　円口類のムラサキヌタウナギ5匹、硬骨魚類のフナ、コイ、大陸バラタナゴ、テラビア、イシガレイ、ヤリタナゴ、メジナ、シマイサキ、コチ、クロホシフエダイ、アユ、イワナ、キス、サザナミフグ、ニジマス、キューセン、マダイ、マコガレイ、カワハギおよびライギョなど20種類計89匹、両棲類のイモリ(有尾)とウシガエル(無尾)各5匹、そして爬虫類のカナヘビとミドリガメ各5匹を心臓介在細胞の種間分布調査の研究材料とした。

　組織の採取および固定に際し、魚では骨切り用の小形はさみを用いて背側体表より断髄(大きい魚では断頭)、両棲類および爬虫類動物ではエーテル麻酔をかけたのちに、腹側体表を切開して心臓を露出させた。直ちに2.5%グルタルアルデヒドと4%バラホルムアルデヒドを含む固定液(1/15Mリン酸緩衝液でpH7.4に調整;使う直前に数滴の1%四酸化オスミウム液を加えたもの。液温約4℃)を拍動する心臓の表面にかけ、ついで隣接臓器がついたままの心臓を採取し、同固定液の入ったシャーレに移し、実体顕微鏡の下で洞房弁とその基部領域の切り出しを行った。採取したサンプルは冷蔵庫の中で一晩固定し、次に1%四酸化オスミウム液に移し、約90分間後固定、漸強エタノール液で脱水、プロピレンオキサイドによる置換を経てエポキシ樹脂への包埋を行った。樹脂包埋標本から厚さ約1mの切片を作製し、1%トルイジンブルー液で染色後、光学顕微鏡で洞房境界部を同定し、そして同部位を電子顕微鏡用の大きさにトリミングし、厚さ約0.1mの切片を作製した後、まず酢酸ウラニル飽和水溶液、のちにクエン酸鉛による二重染色を施した。JEX-100CX電子顕微鏡で観察した。

　ドジョウを用いた迷切実験では、78匹のドジョウ(体長5〜16cm)を以下の3群に分けて研究材料とした。正常無処置15匹(第1群)、キュビエ管沿いの迷走神経内臓枝の両側性切除(以下は迷切とよぶ)を行い、1〜60日生存させたもの60匹(第2群)、偽手術を行ったもの3匹(第3群)。

　手術に先立つ魚を2-フェノキシエタノールの水溶液(3〜5cc/L)の中に移して麻酔を施した。実体顕微鏡の下(空気中)で迷走神経内臓枝を露出させ、キュビエ管沿いの迷走神経内臓枝部分を脊髄神経(第1、第2脊髄神経の腹側枝)との交差点から約0.5mm離れた遠位部より、0.5〜1.2mmの長さで切除した。ついで傷口を閉じ、皮膚を一針縫合した。偽手術では上記通りに皮膚の切開、迷走神経内臓枝の露出を行い、しかし同枝の切断はせずに傷口を縫合した。手術終了後水に戻された魚は、5〜10分で麻酔から醒めるのが普通であった。手術群(第2群)の魚60匹を3組(1組に20匹)に分けて、異なる時期で3回にわたって同手術を繰り返した。各組20匹の魚を迷切後1、2、3、5、7、15、30或いは60日に2〜3匹ずつ固定した。また偽手術群(第3群)の魚3匹を迷切後3日に固定した。

　ドジョウの迷切実験における組織の採取と固定:正常無処置6匹および偽手術群3匹のドジョウの組織の固定について、上記の介在細胞の種間分布調査グループと同様に洞房弁領域の切片試料のみを作製した。迷切後1〜15日生存させた48匹のドジョウについては、まず魚を麻酔させた後、元の傷口より心臓ならびに切断した迷走神経内臓枝の近位端(延髄寄り)および遠位端(心臓寄り)部分も採取した。また3匹の正常無処置ドジョウについては麻酔後洞房弁領域とキュビエ管沿いの迷走神経内臓技の一部、迷切後30日或いは60日生存させた12匹のドジョウについては麻酔後洞房弁領域と左或いは右側のどちらかの片側の迷走神経内臓枝断端間の再生過程中の部分の神経を採取した。以後の手順については第1部に記した通りである。包埋と染色は第1部の介在細胞の種間分布調査グループと同様に行われた。

　硬骨魚類中心に、円口類、両棲類および爬虫類動物を使用した介在細胞の分布調査により、介在細胞は心臓洞房結節組織内の一般的な構成細胞成分ではなく、硬骨魚類しかもその一部(8種類)の魚種の心臓洞房結節組織にしか認められなかった。介在細胞の分布の規律に関しては確信できるものがまだ得られていないが、淡水魚のコイ科に多くみられる傾向を示す(調べたコイ科のフナ、コイ、大陸バラタナゴ、ヤリタナゴそしてドジョウのいずれにおいても介在細胞の存在が認められた)。介在細胞の細胞質内に見られた散在性のZ-band様構造と約15nmの太いフィラメントの存在状態、並びにそれらに関する変異、つまりZ-band様構造が不規則濃斑から典型的なZ-bandのようなものまで、太いフィラメントがほとんど欠乏している状態からほぼ細胞質内に満ちている状態まで、を全体的に見ると、介在細胞が発生中の筋細胞における筋原線維形成過程中にある筋芽細胞と管状筋細胞の間に位置するものであると思われ、介在細胞の筋近縁性が考えられる。この考えに従えば、仮に介在細胞の系統発生がさらに進んで、筋原線維が形成されると、介在細胞としての重要な特徴の一つを失い、その上洞房結節組織の心筋細胞も豊富な神経支配を受けているため、両者の区別がつかなくなるのでしょう。介在細胞がかなりの魚種の心臓洞房結節組織に認められなった理由はここにあるかもしれない。さらに、哺乳動物の心臓の洞房結節組織及び房室結節組織は系統発生的に静脈洞の開口部を取り巻く輪状筋の遺残物であり、これらの組織の構成細胞は均一の細胞でなく、それぞれ異なった起源を持つことがと考えられており、介在細胞が哺乳類動物の心臓における洞房結節細胞や房室結節細胞のうちの一部の細胞、とくに心臓ペースメーカーの活動に関係する細胞との関連が考慮に価する。また、カハールの間質細胞についての介在説、即ち間質細胞は一種にニューロンであって、神経終末と効果器との間に介して両者の機能を微妙に調節するというアイディアが、硬骨魚の心臓介在細胞にも適用する可能性はあると思われる。そこで、介在細胞は硬骨魚類の心臓のにおいて心臓のペースメーカーとしての機能を有するものことが考えられる。

　ドジョウの迷切実験では、介在細胞と密接している軸索終末の変性像が迷切後2〜3日でピークに達し、迷切後5日ではもうほとんど認められない。しかし、わずかながら正常な軸索終末は依然として認めたれたが、これらの軸索は節後遠心性のものであるほか、切断の部位よりも心臓寄り、さらには心臓内に細胞体をもつ求心性ニューロンからの軸索であるか、あるいは生き残った無髄性節前遠心性線維であるか(遅れて変性する可能性もありうる)、もしくは切断の部位よりも中枢寄りの場所に細胞体を置く偽単極ニューロンの末梢側突起断端からの再生芽が心臓内に再進入している可能性も考えられる。迷切後15日、ドジョウ心臓の洞房結節組織内の再生軸索が認められた。そして迷切60日後ではドジョウの心臓介在細胞への神経支配は正常無処置の場合の約90%の回復を示す。調べたいずれの段階においても(迷切後3〜15日以内という除神経下の状況のもとでも)、介在細胞が依然として独立した細胞タイプとして認められ、やがて軸索再生に伴って高度に密な神経支配を受ける状態に戻る。この点から見ても、介在細胞は決して一般の心筋細胞と同一視できない。介在細胞は、少なくともその細胞基底膜に、例えばラミニン、或いはラミニン・ヘパラン硫酸プロテオグリカン複合体などのような軸索の再生を誘導する細胞外マトリックスの様々な構成成分などにおいて、心筋細胞とは異なる面を備えていることが示唆される。

　硬骨魚類中心に、円口類、両棲類および爬虫類動物を使用した介在細胞の分布調査により、介在細胞は心臓洞房結節組織内の一般的な構成細胞成分ではなく、その分布は硬骨魚類しかもその一部(8種類)の魚種だけに限られている。介在細胞の細胞質内における約15nmの太いフィラメントおよび散在性のZ-band様構造の存在は、介在細胞の筋近縁性を示すが、しかし、ドジョウを用いた迷切実験によっては、迷切後1〜60日にわたって、いずれの時期においても介在細胞は独立した細胞タイプとして認められ、そして軸索再生に伴って高度に密な神経支配を受ける状態に戻り、介在細胞は心筋細胞と決して同一視できないものであることを示唆する。