我々が用いているベクターpKA1は、f1ファージの複製開始領域を有し、クローニングされた遺伝子を一本鎖DNAのf1ファージ粒子として簡単に調製できることに注目した。このf1ファージ粒子をそのままトランスフェクションに使用できれば、トランスフェクション試料調製の簡素化につながるものと考えられる。そこでこれを試み、実際にトランスフェクションできることを見出した。

　1、f1ファージ粒子試料をDEAEデキストランまたはリポポリアミン存在下においてCOS7細胞に加えたところ、粒子中に一本鎖DNAとして含まれていたウロキナーゼ遺伝子およびブラストサイジンS耐性遺伝子の発現が確認された。この試料を各種ヌクレアーゼ処理した場合にも、同様の結果が得られたことから、試料中のfreeのDNAでなしにf1ファージ粒子中に含まれていた一本鎖DNAが発現することがわかった。

　2、DNA1分子当たりのトランスフェクション効率は二本鎖プラスミドの場合よりも上昇していた。

　3、トランスフェクションの至適条件について検討した結果、リポポリアミンの場合、10⁵個のCOS7細胞に対して、大腸菌培養液約10lに相当するファージ粒子を用いれば高効率のトランスフェクションが可能であることがわかった。

　4、SV40複製領域を含むSV40初期プロモーターを除去し、かわりにメタロチオネインプロモーターにより遺伝子を発現させた場合にもトランスフェクションが成立した。このことから、このトランスフェクションには、SV40複製領域は必須ではないことが示された。また、この方法をCOS7以外の培養細胞について試みたところ、検討を行ったいずれの細胞にも応用可能であり、ラージT抗原非産生細胞の場合にもトランスフェクションが成立した。以上から、この方法はCOS7のようなラージT抗原産生細胞を宿主とし、SV40複製領域を有するプラスミドを用いる系に限られたものではなく、より一般的に使用できるものと思われる。

　5、しかし、最も高効率が得られたのはSV40初期プロモーターとCOS7の系であり、この理由のひとつとして、一本鎖から二本鎖にDNAが変化した後の、SV40複製領域とラージT抗原の作用によるプラスミドの増幅効果が考えられた。

　6、この方法では、必要とされる大腸菌培養液がごく少量であり、しかもファージ粒子の調製が二本鎖プラスミドに比べ簡単で、DNAの精製も不要である。このため多数の試料を対象としたアッセイ系に用いるには適当であると考えられる。

　未知のcDNAが分泌蛋白質をコードしているかどうかを判定する目的で、シグナルペプチドを標的に、未知cDNAの5’端フラグメントに、レポーター遺伝子として活性の明らかな蛋白質の遺伝子をつないだキメラ遺伝子を作成し、これを発現させ、培地中のレポーター蛋白質の活性を調べるというシステムを考案した。既知の分泌蛋白質およびタイプ1膜蛋白質のシグナルペプチドcDNAを用いたモデル実験においてシステムが動くことを確認した。

　1、ベクターとしてpSSD1を構築した。レポーター遺伝子としては、活性の検出が簡単で特別な装置を必要としないという利点を持つウロキナーゼのプロテアーゼドメインに相当するcDNAフラグメントを用いた。

　2、ウロキナーゼ自身のシグナルペプチドに相当するcDNAの全体あるいはその一部を用いたモデル実験において、コントロールとして発現させた完全長ウロキナーゼcDNAと同程度の活性が検出されたのはシグナルペプチドcDNAの全体を用いた場合のみであった。シグナルペプチドcDNAの一部を用いた場合、活性は激減、あるいは全く検出されなかった。この結果から、このアッセイ法ではシグナルペプチドをコードする部分を完全な形で含むcDNAフラグメントのみを特異的に検出できることがわかった。

　3、既知の分泌蛋白質およびタイプ1膜蛋白質のシグナルペプチドcDNAを用いた場合、いずれのキメラ遺伝子についても、その発現産物のウロキナーゼ活性が培地中に検出された。このことから、この方法がウロキナーゼ以外の分泌蛋白質に由来するシグナルペプチドの検出についても有効であることが確認された。

　我々がこれまでに得た約600種類の新規cDNAについて、実際にこのアッセイ法を応用し、シグナルペプチドをコードするものの選出を行なった。

　1、一次スクリーニングの結果、約50種をN末端付近に疎水性に富む領域を有する候補クローンとして選出した。

　2、このなかで、まず、10種のクローンを選び、上記の方法でキメラ遺伝子を作製した。この場合、フレームが合うのは、理論的には3分の1の確率である。実際にある候補クローンについて、この点を確かめたところ、3個に1個の割合でフレームの合ったキメラ遺伝子が得られた。

　3、10種の候補クローンのうち7種は、ウロキナーゼ活性が培地中に検出され、シグナルペプチドをコードするものであることがわかった。

　4、1種では、ウロキナーゼ活性は培地中には全く検出されず、細胞表面においてのみ検出された。このクローンはおそらくタイプ2膜蛋白質をコードするものと考えられる。

　5、シグナルペプチドの存在が確認されたクローンの一部について、その全塩基配列を決定し、ホモロジー検索を行なったところ、1種のクローンがTGF-スーパーファミリーの幾つかのメンバーと20〜40%のホモロジーを有していた。さらにこのクローンは、C末端領域中のシステインの位置、活性化プロセシング部位と見られるアルギニンに富む領域などTGF-スーパーファミリーの特徴を有していることから、このファミリーに属する新規蛋白質ではないかと考えられる。各組織についてのノザン解析の結果、このクローンに相当するmRNAは胎盤、前立腺、回腸、腎臓で発現していた。特に胎盤では大量発現が認められたことから、この新規蛋白質は妊娠、出産などに関連した重要な生理機能を持つ可能性が考えられる。