100ppmのPhIPの経口投与により誘発された乳癌10個のうち2個と、400ppmのPhIPにより誘発された乳癌7個のうち1個で、Ha-rasのコドン12の2番目の位置に、GからAへの変異を認めた。Ha-rasのexon2,exon3,Ki-及びN-rasでは、突然変異は認められなかった。p53遺伝子に関しては、解析した乳癌10個のうち1個で、コドン130の3番目の位置にGからTへの変異が確認された。

　そこで、本研究に引き続き、(SDxF344)F₁ラットに同様にして誘発した乳癌を用いてLOHを解析したところ、乳癌15個中4個(27%)で、染色体10番Ppy付近でのLOHを見いだした。この付近はヒト染色体17qのBRCA1よりもさらにtelomere側にsyntenyをもち、ヒト乳癌でもLOHが認められる。更に、これら15個の乳癌では、低率(1.9%)のmicrosatellite instability(MI)が認められることも見いだした。PhIPにより誘発されたラット乳癌は、17qBRCA1より遠位にLOHをもち、低率のMIを認めるヒト乳癌の良いモデルになると期待される。

　400ppmのPhIPの経口投与により誘発された大腸癌9個、300ppmのIQの経口投与により誘発された大腸癌11個と大腸腺腫2個、500ppmのGlu-P-1の経口投与により誘発された大腸癌7個について解析した。ras群遺伝子では、Glu-P-1により誘発された大腸癌7例のうち1例で、Ki-rasのコドン12の2番目の位置にGからTへの変異が認められた。p53の突然変異は、PhIP,IQ,Glu-P-1の何れの腫瘍においても突然変異は認められなかった。これらは、ヒト大腸癌の40-50%でKi-rasの突然変異が、約70%でp53の突然変異が認められることと対照的であった。

　そこで、本研究に引き続き、ラットのApc遺伝子をクローニングし、PhIP及びIQにより誘発された大腸癌での関与を検討した。PhIPにより誘発された大腸癌8個のうち、4個の腫瘍で、合計5個の突然変異が検出された。5個すべてが、5’-GGGA-3’配列でのGの欠失で、5個のうち4個については、5’-GTGGGAT-3’と7塩基の配列が共通であった。一方、IQにより誘発された合計13個の腫瘍うち2個でApc遺伝子の突然変異が検出されたが、特徴的な配列はなく、PhIPによる突然変異は極めて特徴的と考えられた。

　さらに、PhIPにより誘発された大腸癌では低率(1.6%)のMIが認めらたのに対し、IQにより誘発された大腸腫瘍では、全くmicrosatelliteの変化は認められなかった。PhIPによる大腸癌で認められたMIは、PhIPによる乳癌でのMIと同様に低率であり、PhIPに特異的な低率のMI誘発機構が存在するのではないかと考えられた。

　乳頭腫2個、扁平上皮癌13個について、Ha-,Ki-,N-rasの突然変異をPCR-SSCP法により解析した。Ha-rasのexon1に7個(コドン12の2番目の位置のG to A:6個、コドン13の1番目の位置のG to C:1個)、exon2に4個(コドン61の1番目の位置のC to A)、Ki-rasのexon1に2個(コドン12の1番目の位置のG to T)の突然変異を認めた。合計すると、乳頭腫2/2、扁平上皮癌11/13、という極めて高い頻度でras群遺伝子の突然変異が認められ、IQによるラットZymbal腺腫瘍には、ras群遺伝子の関与が大きいと考えられた。本研究と並行して、同一の腫瘍に関してp53の突然変異を解析したところ、解析した扁平上皮癌13個のうち4個でp53の突然変異が認められたが、特に特徴的な突然変異は認められなかった。

　MeIQによりCDF₁マウスに誘発された前胃腫瘍4個と、それらとは別の前胃腫瘍を培養細胞株としたもの4個についてp53遺伝子の突然変異を検索した。前胃腫瘍2個(F12,F14)と、細胞株4個全部(M33,M40,F34,F35)で、突然変異を認めた。F12,M33,M40では、LOHを伴う点突然変異を、F14では、LOHを伴わない点突然変異を、認めた。F34とF35では、それぞれ2箇所に突然変異を認め、それぞれの細胞株の2つの突然変異は、原則的には異なるalleleにのっているものの、突然変異を両方持つクローンや、どちらも持たないクローンがあり、gene conversionによる可能性が考えられた。

　PhIPによる大腸癌でのApc遺伝子の突然変異は、検出された5個の突然変異全てが5’-GGGA-3’配列でのGの欠失と、極めて特徴的であった。lacI遺伝子のトランスジェニックマウスであるBig Blueマウス及びラットを用いて、PhIPが正常大腸粘膜で誘発する突然変異を解析したところ、PhIPはGの1塩基欠失を起こしやすく、その配列として5’-GGGA-3’配列が多いことが確認された。PhIPが正常大腸粘膜で誘発しやすい突然変異は、腫瘍のApc遺伝子で検出される突然変異とよく一致し、PhIPのmutational fingerprintとして、大いに役立つことが期待される。ヒトの大腸がんでも、5’-GGGA-3’でのGの1塩基欠失が認められている。

　更に、PhIPのもう1つの特徴として、低率のMIを誘発することがあり、この低率のMIもPhIPのmutational fingerprintとして役立つ可能性がある。

　MeIQによるマウス前胃腫瘍で検出されたHa-rasの突然変異は、すべて、コドン13のGGCからGTCへの変異であった。また、MeIQにより誘発されたラットのZymbal腺での解析でも、Ha-rasコドン13のGGCからGTCへの変異が多いことが報告されている。

　本研究に続き、Big Blueマウスを用いたin vivoでの解析により、MeIQが突然変異を誘発する塩基配列の多くは、5’-GC-3’のGであることを証明した。ラット及びマウスのHa-rasのコドン12はGGA、13はGGCである。コドン13に選択的に突然変異が誘発された理由は、5’-GC-3’のGがMeIQのhot spotであることによると考えられた。