スギ花粉症はスギ花粉中の蛋白をアレルゲンとしたI型アレルギー反応による疾患である。わが国の20〜30代の成人において、スギ花粉特異IgE抗体陽性率は30%前後に達し、スギ花粉症の発病率も10%ほどと推定されている。スギ花粉症はわが国では、最も重要なアレルギー疾患の1つである。

　スギ花粉症における研究は、この数年間に飛躍的に進んできた。しかしいまだに根治療法は、確立していない。本研究において、スギ花粉主要アレルゲンと生体との反応を検討することを目的として、マウスにおけるスギ特異的IgEの産生に関して基礎的研究を行った。

2)スギ主要アレルゲンCry j1で免疫したマウスで産生されたIgEおよびIgG抗体の認識するCry j1エピトープの解析

　Cry j1をマウスに腹腔内投与し、得られたマウスのCry j1特異的IgEとIgGが認識するB細胞エピトープの解析を、モノクローナル抗体を用いたELISA Inhibition法により行った。

研究方法

　6〜8週令の雌のBalb/cマウスにCry j1と水酸化アルミニウムゲル(Alum)を腹腔内に投与した。感作6回目の2週間後に、血清を得た。血清は、IgE-capture ELISA法でスギ花粉特異的IgE抗体を、間接法ELISA法でスギ花粉IgG抗体を測定し、その抗体価が上昇した血清を用いて以下の実験を行った。

IgE-B細胞エピトープの解析

　Cry j1を感作したマウスの血清より、ProteinAおよびProteinGを用いてマウスIgGを除いた後に実験に用いた。抗原決定基の異なる5種類の抗Cry j1モノクローナル抗体(EP-1〜EP-5)を用いて、マウス血清中の抗Cry j1IgE抗体とCry j1に対する結合を阻止することによりエピトープを解析した。

IgG-B細胞エピトープの解析

　Cry j1を感作したマウスの血清より、ProteinAによりIgGを精製して用いた。IgG-B細胞エピトープは、精製したマウス血清中の抗Cry j1IgGが、抗Cry j1モノクローナル抗体とCry j1との結合を阻害することによりエピトープを求めた。

結果IgE-B細胞エピトープの解析(図1)

　IgE-B細胞エピトープの解析には、スギ花粉特異的IgE抗体が、1,810PCAユニットに上昇した血清を用いた。マウスのスギ花粉特異的IgE抗体とCry j1との結合を、EP-1、EP-4、EP-5の抗Cry j1モノクローナル抗体が阻止した。これにより、Cry j1を感作したマウスの抗Cry j1IgEはスギ花粉アレルゲンCry j1のEP-1、EP-4、EP-5を認識していることがわかった。

IgG-B細胞エピトープの解析(図2)

　IgG-B細胞エピトープの解析には、スギ花粉特異的IgG抗体が、51,500ユニットに上昇した血清を用いた。EP-1、EP-4、EP-5の抗Cry j1モノクローナル抗体とCry j1の結合が、マウス抗Cry j1IgGによって強く阻止された。このことより、Cry j1を感作したマウスの抗Cry j1IgGも抗Cry j1IgEと同様に、EP-1、EP-4、EP-5を強く認識していることがわかった。また抗Cry j1IgGはEP-2、3も弱く認識し、幅広いエピトープを認識することがわかった。

図1.モノクローナル抗体を用いたマウスIgE-B細胞エピトープの解析図2.モノクローナル抗体を用いたマウスIgG-B細胞エピトープの解析

　本研究は、スギ花粉主要アレルゲンと生体との反応を検討することを目的として、マウスにおけるスギ特異的IgEとIgGの産生に関して基礎的研究を行ったものであり、下記の結果を得ている。

　1.Cry j1およびCry j2で免疫したマウスの血清中のCry j1とCry j2特異的IgE抗体値を、IgE-capture Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)法 とPassive Cutaneous Anaphylaxis法(PCA)法を用いて比較したところ、Cry j1およびCry j2特異的IgE抗体値はどちらも有意に相関を認めた。

　2.コレラトキシンBサブユニット(CTB)と微量のコレラトキシン(CT)をアジュバントとして、より自然に近い感作状態である経鼻投与によってCry j1、Cry j2を、マウスに免疫したところ、CTBをアジュバントとして感作したマウスにおける抗Cry j2IgEおよびIgG抗体は、高い抗体応答を示した。アジュバントを用いなかったマウスの抗Cry j1およびCry j2IgE抗体産生は、全く認められなかった。

　3.CTBとCTをアジュバントとして感作したマウスにおける顎下リンパ節細胞の抗原特異的増殖反応の測定を行ったところ、Cry j2で刺激したリンパ節細胞の増殖が著しく認められた。

　4.スギ主要アレルゲンCry j1を腹腔内投与したマウスで産生されたIgEの認識するCry j1エピトープの解析を、抗原決定基の異なる5種類のモノクローナル抗体(EP-1〜EP-5)を用いたELISA Inhibition法により行ったところ、Cry j1を感作したマウスの抗Cry j1IgEはスギ花粉主要アレルゲンCry j1のEP-1、EP-4、EP-5を認識していることがわかった。マウスで産生されたスギ花粉特異的IgE抗体が、ヒトやサルと同様に、EP-1を認識していたことが示された。

　5.スギ主要アレルゲンCry j1を腹腔内投与したマウスで産生されたIgGの認識するCry j1エピトープの解析を、同様のモノクローナル抗体(EP-1〜EP-5)を用いたELISA Inhibition法により行ったところ、Cry j1を感作したマウスの抗Cry j1 IgGも抗Cry j1IgEと同様に、EP-1、EP-4、EP-5を強く認識していることがわかった。また抗Cry j1IgGはEP-2、3も弱く認識し、幅広いエピトープを認識することがわかった。スギ花粉主要アレルゲンにおいては、IgEやIgGは同じようなエピトープを認識し、IgEやIgGを産生していることが推測された。

　以上、本論文はスギ花粉症治療を目的とした研究の初期段階においての治療効果を判定することに有用であると考えられる動物モデルを作製した。加えて、アレルゲンのB細胞エピトープの解析において、いままで行われていなかった、マウスのIgEとIgGが認識するエピトープを比較し、IgEやIgGは同じようなエピトープを認識し、IgEやIgGを産生していることが推測された。本研究は、これまで行われていなかった、マウスのIgEとIgGが認識するエピトープを比較することにより、アレルゲンに対する免疫反応を制御することを目的とした、免疫反応の機序の理解において、重要な貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。