マウスゲノムライブラリーよりモルモットPAF受容体cDNAをプローブにしてスクリーニングした。

　マウスPAF受容体遺伝子の染色体上のマッピングには直接Rバンド蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)法を用いた。スライドガラス上に展開した染色体DNAを熱処理してガラスに固着させ、変成させた。ビオチン16-dUTPを用いてラベルしたプローブとハイブリダイゼーション後、続いて蛍光化アビジンを結合させた。プロピジウムイオダイドで染色体を染め、励起光を用いて観察した。

　野生型マウスMus spretusの雄と実験用近交系マウスC57BL/6Jの雌を交配して得られたF₁雌マウスに対し、Mus spretusの雄と戻し交雑をかけて雑種F₂マウス146匹を得た。これらのマウスの母親由来のPAF受容体遺伝子がMus spretusタイプかC57BL/6Jタイプかのタイピングをサザンハイブリダイゼーションで行った。またこの遺伝子に連鎖しているマイクロサテライトDNAマーカーについてもPCRでタイピングした。

　サイトメガロウイルスIE(immediate early)エンハンサー、チキン-アクチンプロモーターの下流にモルモットPAF受容体cDNAを連結し受精卵の前核へマイクロインジェクションした。マウスの遺伝子型はゲノムDNAを鋳型にPCRで決定した。トランスジェニックマウス系統は雄のトランスジェニックマウスを雌のBDF₁マウスと交配して継代した。

　ホスホグルコキナーゼプロモーターにネオマイシン耐性遺伝子を連結したDNA断片をマウスPAF受容体遺伝子のエクソン中にあるPstIサイトに挿入した。MClプロモーターにチミジンキナーゼ遺伝子を連結したDNA断片と組み合わせて、ターゲティングベクターを構築した。薬剤耐性形質転換ES細胞株の中から相同組換え細胞を、サザンブロット解析によってスクリーニングした。相同組換え体ES細胞をC57BL/6Jの胚盤胞に注入してキメラマウスを作った。雄のキメラマウスの子孫からヘテロザイゴートマウスをサザンブロット解析で同定し、それらを交配させて実験に使用した野生型(PAFR^+/+)とPAF受容体ホモ欠損(PAFR⁺)マウスを得た。

　マウスを麻酔後、気管切開した気管に金属製のカニューレを挿入し、人工換気下においた。胸郭を開き、麻痺剤で自発呼吸を止めた。実験中は酸素ガスを供給した。気道内圧と気道流量を圧トランスデューサーと呼吸流速計でそれぞれ測定した。これらの測定値を基に肺抵抗を計算した。気道抵抗の基線を測定後、PAF(10g/kg)を頸静脈から注射した。メサコリンエアゾールはカニューレから投与した。

　マウスを麻酔後、右大腿動脈にカニュレーションした。チューブはヘパリンを含む生理食塩水で満たし、圧トランスデューサーに接続した。血圧の信号をアンプで増幅し、テープレコーダーに記録した。このデータをコンピューターに取り込み、平均血圧を求めた。心拍数は心電図を基にタコメーターで計算した。

　マウスに100gの卵白アルブミンと1mgの水酸化アルミニウムゲル、300ngの百日咳毒素の混合液を腹腔内に投与した。18〜21日後、卵白アルブミンを静脈投与して全身アナフィラキシーを惹起した。

　卵白アルブミン投与して10分後のマウスより肺を取り出した。湿重量を測定後、対流式オーブンで乾燥させた。乾燥重量を測定し、湿重量/乾燥重量比を計算した。

　マウスにエンドトキシンを尾静脈から投与し、その生死を3日間観察した。または頸静脈から投与し、平均血圧の変化を測定した。

　プラークハイブリダイゼーション法によりマウスPAF受容体遺伝子をクローニングした。この遺伝子は蛍光in situハイブリダイゼーションと分子生物学的連鎖解析によって、マウス4番染色体のD2.2バンドの領域にマッピングされた。ノーザンブロット解析によりPAF受容体mRNAの高い発現が腹腔マクロファージで確認できた。C3H/HeNマウスのマクロファージをエンドトキシンまたは合成リピドAで処理すると、PAF受容体mRNAレベルが上昇した。またリポ多糖非反応性マウスであるC3H/HeJのマクロファージは、合成リピドAには反応しなかったがエンドトキシン中の混入物に反応した。以上のPAF受容体遺伝子の発現誘導パターンは腫瘍壊死因子(TNF-)のものと似ていた。エンドトキシンは遺伝子発現の誘導によりPAF受容体タンパク質のマクロファージ上の発現量を増加させ、それによって細胞や個体のPAFへの反応性を上昇させていると考えられた。

　PAFは単離した細胞や組織に多彩な影響を及ぼすが、in vivoで重要な病態生理学的役割を果たしているかどうかについては依然として議論がある。この疑問に答えるため、-アクチンプロモーターの制御でモルモットPAF受容体を過剰に発現するマウスを作製した。このトランスジェニックマウスは生殖能力に異常があった。PAF受容体mRNAの過剰に発現は心臓、骨格筋、気管、皮膚、眼、大動脈などで観察され、実際に心臓や気道はPAFに敏感に反応した。さらにメサコリンに対して気道過敏性を、またエンドトキシンに対しては致死率の上昇を示した。皮膚ではメラニン形成と細胞増殖に異常が観察された。また一部のトランスジェニックマウスには高齢になると自然にメラノサイト腫瘍が現れた。したがってPAF受容体トランスジェニックマウスは、気管支喘息やエンドトキシンショック、不妊症の基礎的な病態生理を研究したり、これら疾患の治療法をスクリーニングするための有用なモデルとなることがわかった。さらにこのトランスジェニックマウスから皮膚組織の形態形成や細胞分裂活性という新しいPAFの作用に関しても示唆が得られた。

　次にPAFの作用を生来欠損させた時に現れる病態を明らかにすることを目的として、マウス胚幹細胞内で相同組換えによりPAF受容体遺伝子を破壊した。この細胞より樹立したPAF受容体欠損マウスは雌雄ともに生殖能力に異常はなかった。また血圧も正常だった。能動免疫したPAF受容体欠損マウスに全身アナフィラキシーを惹起したところ、野生型マウスに比べ気道収縮、肺浮腫、低血圧、致死性が顕著に減弱していた。したがってアナフィラキシーショック時にPAFは、気管支肺系や心血管系の機能不全に主要な役割を果たすだけでなく、致死性のメディエーターとしても機能することが明らかになった。一方、PAF受容体欠損マウスにエンドトキシンを投与しても野生型マウスに比べ、致死率と血圧低下反応に差は認められなかったことから、PAFはエンドトキシンショックの必須のメディエーターではないことも明らかになった。