高等担子菌類におけるRFLP分析のためのmtDNAの分離法の検討を行い,既往の2,3のmtDNA分離法を組み合わせ,また,一部改変することで新たな分離法を開発した。この方法によって,6種類(ヤナギマツタケ,マイタケ,ウシグソヒトヨタケ,シイタケ,タモギタケおよびヒラタケ)の菌種の凍結乾燥菌糸体1gからRFLP分析に充分な量(20-50g)の純度の高いmtDNAを得ることができた。分離した高等担子菌6種類のmtDNAは各種制限酵素により切断され,それらのRFLP分析では,ヤナギマツタケ,マイタケ,シイタケおよびヒラタケの4種のmtDNAに多型性のあること,ならびにヤナギマツタケ,マイタケおよびタモギタケのミトコンドリアゲノムサイズはそれぞれ,80,127および64kbであることを初めて明らかにすることができた。さらに,上述の分離法を一部改良することによってプロトプラストから完全な環状のmtDNA分子の分離が可能であり,担子菌類では初めてそれを電子顕微鏡下で捉えることができた。このように,本研究で確立したmtDNA分離法は高等担子菌類の分子遺伝学的研究に十分活用できる効率的かつ汎用性に優れたものであると判断した。

　ヒラタケの自然集団における遺伝的多様性の程度を推察する目的で,北半球において地理的分布の異なる34の野生菌株間(日本産18株,韓国産1株,ヨーロッパ産10株およびアメリカ産5株)の系統的類縁関係をmtDNAのRFLPとアイソザイムを指標として検討した。その結果,供試した34の野生菌株のmtDNAは制限酵素BamHI,EcoRIおよびEcoRVによる消化によってそれぞれ,18,19および19の異なるRFLPパターンを示し,これら3酵素のRFLPパターンを組み合わせることによって22種類のmtDNAフェノタイプに類別できた。22種類のフェノタイプは各フェノタイプ間の非類似度係数に基づいたUPGMA(unweighted pair-group method using arithmetic means)法およびFicth-Margoliash法による系統的類縁関係の解析により,それぞれ極東アジア産,ヨーロッパ産およびアメリカ産の菌株で得られたフェノタイプにより構成される3つのグループに大別され,自然集団の地理的分布の違いと系統的類縁関係に密接な関係のあることが示唆された。5酵素(アルコール脱水素酵素,酸性フォスファターゼ,エステラーゼ,ラッカーゼおよびリンゴ酸脱水素酵素)についての等電点電気泳動法によるアイソザイム分析では,全菌株がそれぞれ固有の電気泳動フェノタイプを示し,それらフェノタイプ間の非類似度係数に基づいた系統的類縁関係の解析はmtDNAのRFLPを指標とした解析とほぼ一致する結果を示した。以上のことから,ヒラタケは核DNAよびmtDNAの両方からみて地理的分布域に対応する遺伝的に極めて多様ないくつかの自然集団を包含していることが明らかとなった。

　和合性一核菌糸体間の交配におけるmtDNAの伝達様式を検討した結果,交配コロニーの接触部を除いた部分より分離される新生二核菌糸体はすべて核受け入れ側一核菌糸体のmtDNAを保有しており,mtDNAは基本的には片親遺伝(uniparental inheritance)であることが示された。加えて,上記の交配接触部に形成される新生二核菌糸体のmtDNA型は,両親mtDNAの組換えによって生じた新しいRFLPパターンを示すmtDNA(組換え体mtDNA)を保有することがわかった。接触部でのmtDNAの組換え現象は頻繁に認められ,また,特定の交配組み合わせに限定されなかったことから,ヒラタケでは片親遺伝に加え,交配接触部においては両親mtDNAの組換えによる両親遺伝(biparental inheritance)が普遍的に起きていることが判明した。さらに,交配コロニーの両親一核菌糸体接触部より発生した子実体の中に組換え体mtDNAを保有するものが認められたことから,自然界におけるmtDNAの組換え体の子孫への伝達の可能性が示されるとともに,ヒラタケの自然集団で認められたmtDNAの多型性と交配における組換え体mtDNAの出現との密接な関係が示唆された。

　RFLPの異なる2種類のmtDNAについてフィジカルマップを作成し,ヤナギマツタケ由来の3種類のミトコンドリア遺伝子,チトクロームオキシダーゼ・サブユニット1,25S-リボゾームDNAおよび18S-リボゾームDNAをマッピングすることで,それらのゲノム構造上の配置を比較したところ,両mtDNAゲノムにおけるRFLPの違いとは対照的に3種類の遺伝子の配列順序は極めて類似性の高いことが判明した。また,両mtDNAゲノムとその組換え体mtDNAゲノムのフィジカルマップを比較することにより,mtDNAゲノム上の組換え部位は少なくとも2-3箇所あることが推定された。

　ヒラタケの育種の効率化に寄与する知見を得ることを目的として,mtDNAのRFLPの差異が菌株の表現形質に影響しうるかを検討した。既存栽培品種のmtDNAを核構成を変えることなく異なるRFLPのmtDNAに置換した細胞質置換二核菌糸体株を作成し,それらの間で種々の生物学的性質について比較分析した結果,元の栽培品種(元株)と細胞質置換二核菌糸体株との対峙培養において,mtDNAのRFLPの違いだけでは帯線形成(個体識別反応)は誘導されないことがわかった。等電点電気泳動分析によって得られた細胞質置換二核菌糸体株のエステラーゼおよびリンゴ酸脱水素酵素のアイソザイムパターン,ならびに可溶性蛋白質の泳動パターンは元株のパターンと一致したことから,mtDNAの置換はこれらアイソザイム等の遺伝的背景に影響をおよぼさないことが示唆された。また,細胞質置換二核菌糸体株と元株の菌糸体生長度および菌糸体コロニーの形態,栽培における菌糸体生長,子実体の形成能力および子実体の形態的特徴を比較検討したところ,これらの諸形質にmtDNAのRFLPの違いに起因すると考えられる差異は認められず,さらに,細胞質置換二核菌糸体株と元株の菌糸体を混合した種菌を用いた栽培においても上記の諸形質への影響は認められなかった。しかしながら,ヒラタケmtDNAのクロラムフェニコール耐性変異は菌糸体生長度や子実体の形態など,菌株の表現形質に大きな影響をおよぼすことが明らかとなった。以上のことから,mtDNAの遺伝子領域に起こる変異は本菌の遺伝的背景に変化をもたらすと考えられるが,mtDNAのRFLPの違いがヒラタケ栽培において重要な上述の諸形質におよぼす影響は極めて小さいものであると考えられた。

　mtDNAのRFLP情報の育種への利用の可能性を検討するため,ヒラタケ自然集団の中でmtDNAのRFLPから見て遠縁あるいは近縁の関係にある菌株を用いて交雑株を作出し,それらの間で子実体の生産性を比較した。その結果,遠縁の関係にある組み合わせほど生産性に優れたF₁を作出し易い傾向が示された。また,高い子実体収量値を示したF₁株の自植株では,親のF₁株を越える子実体収量を示したものはなく,形態的に劣悪な子実体が30%程度の頻度で認められ,明瞭な自殖弱勢が示された。このことから,品種改良によって子実体の生産性を高める上で,菌株間の遺伝的関係,すなわち遺伝的に遠縁の関係にある組み合わせの交雑を重視する育種プログラムが重要であり,その意味で本菌自然集団は育種素材として有用であり,これらを育種場面に導入する際,mtDNAのRFLPは菌株間の遺伝的類縁関係を把握するための一つの有効な分子マーカーとして利用できるものと判断した。

　以上を要するに,本研究はヒラタケのmtDNAのRFLPを指標とし,従来不明であった本菌の自然集団間の系統的類縁関係および交配におけるmtDNAの伝達様式を明らかにし,それらの知見に基づき本菌の細胞の形質発現におよぼすmtDNAの影響,ならびに育種へのmtDNAのRFLP情報の利用について遺伝・育種学的見地から検討を加えたものである。