SDラットに¹⁴C-E3040を1mg/kg静脈内投与した後の両抱合体の血漿中濃度推移、および累積尿、胆汁中排泄を検討した。E3040は半減期2〜4分で速やかに血漿中より消失し、グルクロン酸、硫酸抱合体が血漿中に検出された。この時生体内で生成したグルクロン酸抱合体の約95%、硫酸抱合体の約55%が胆汁中へ排泄された。両抱合体の胆汁排泄には肝臓で生成されたものが直接胆汁排泄される場合(Route1)と、肝臓や他の臓器で生成されたものが血液中へeffluxされ、肝臓へ再取り込みされた後胆汁排泄される場合(Route2)が考えられる。E3040抱合体生成には肝臓以外の臓器の寄与があること、かつ、抱合体が血液中へeffluxされることを考えあわせると、E3040抱合体の胆汁排泄にはRoute1ばかりではなくRoute2を介した排泄も起こっていると考えられた。この結果から両抱合体の胆汁排泄には血液中から肝臓中への取り込みが必須の過程であり、肝取り込み能を評価することが両抱合体の肝胆系移行動態を解析するうえで重要であることが示された。

　トレーサー量の¹⁴C-E3040グルクロン酸、硫酸抱合体をSDラットに静脈内投与した後の体内動態解析において、両抱合体の累積胆汁排泄率をそれぞれのAUC∞で除することにより得られる胆汁排泄クリアランス(CL_bile)が全身クリアランス(CL_tot)の95%(グルクロン酸抱合体)、62%(硫酸抱合体)を占め胆汁排泄が両抱合体の主な消失経路であることが明らかとなった。この結果からも血液中へeffluxされた両抱合体は効率的に肝へ取り込まれた後、胆汁排泄されていることが示された。

　¹⁴C-E3040グルクロン酸、および¹⁴C-E3040硫酸抱合体を用いた瞬時投与灌流法(Multiple Indicator Dilution(MID)法)により肝臓への取り込みクリアランス(PS_inf)を算出した。MID法はリガンドとリファレンス化合物(¹²⁵I-BSA)の混液を瞬時投与後、肝臓からの排出液の時間推移(dilution curve)を解析することによりリガンドの肝への取り込み、肝から灌流液への排出、および肝内でのsequestration過程を分離評価できる灌流法である。dilution curveを解析することにより得られるグルクロン酸、硫酸抱合体のPS_infはラットにおける肝血漿流量と同等以上の高い値であった。この結果から両抱合体の肝取り込みにおける輸送系の寄与が示唆された。また、両抱合体のPS_infを灌流液中の非結合型分率で補正したPS_u,infは硫酸抱合体がグルクロン酸抱合体に比べ約3倍大きく、本質的な肝取り込み能は硫酸抱合体の方が大きいことが示された。

　¹⁴C-E3040グルクロン酸、硫酸抱合体の遊離肝細胞への取り込み実験により肝取り込み機構について検討した。両抱合体の遊離肝細胞への取り込みはいずれも濃縮性、飽和性、温度依存性、代謝阻害剤による取り込み初速度の低下を示し、両抱合体の肝への取り込みはエネルギー依存性の能動輸送であることが示された。両抱合体の肝取り込みは一つの飽和性のコンポーネントと一つの非特異的なコンポーネントから成り、硫酸抱合体の取り込みがグルクロン酸抱合体に比べ高親和性、高capacityを示した。線形領域における全取り込みに対する能動輸送の寄与はグルクロン酸抱合体で89%、硫酸抱合体で98%と肝取り込みのほとんどが能動輸送に依存していることが明らかとなった。両抱合体の肝取り込みは有機アニオン系色素であるジブロモスルフォフタレイン(DBSP)、コール酸、タウロコール酸によりいずれも濃度依存的に阻害された。また両抱合体は互いに相互阻害を示した。DBSP、グルクロン酸、硫酸抱合体を用いた阻害実験からE3040グルクロン酸、硫酸抱合体、およびDBSPはともに競合阻害を示すことから、同一の輸送担体により肝中へ取り込まれているものと考えられ、いわゆるNa⁺-independent organic anion transporter(OATP)が両抱合体の輸送に関与していることが示唆された。

　EHBRに¹⁴C-E3040を1mg/kg静脈内投与した後の両抱合体の血漿中濃度推移、および累積尿、胆汁中排泄を検討した。E3040の半減期、血漿中AUC∞、全身クリアランスはSDラットと比べて変化は認められなかった。一方、グルクロン酸抱合体の血漿中からの消失はSDラットに比べ著しく遅延し、AUC∞も約12倍大きな値であった。またグルクロン酸抱合体の尿、胆汁中排泄もSDラットと大きく異なり、胆汁排泄の著しい低下と尿中排泄の増加が認められた。しかしながら硫酸抱合体の血漿中濃度推移、尿、胆汁中排泄に両ラット間で差は観察されなかった。ここで両抱合体の累積尿、胆汁中排泄率を血漿中AUC∞で除することにより得られる尿、胆汁排泄クリアランス(CL_renal、CL_bile)を比較すると、グルクロン酸抱合体のCL_bileのみEHBRにおいて著しい低下が観察された(SDラットの約1/70)。この結果からEHBRにおけるグルクロン酸抱合体の尿中排泄の上昇は血漿中AUCの上昇に伴う二次的な変化であるのに対し、胆汁排泄の低下は胆汁排泄過程の障害のために起こったものであることが示唆された。

　両抱合体の肝胆系移行における肝臓から胆汁中、あるいは血液中(灌流液)への排泄過程を解析するため、¹⁴C-E3040の定常状態肝灌流法により肝臓中で生成する両抱合体の胆汁中への排泄クリアランス(CL_u,bile)、肝臓から血液(灌流液)中への排出クリアランス(CL_u,outflow)を算出した。ここでCL_u,bileおよびCL_u,outflowは、胆汁中、灌流液中への両抱合体の排泄速度をそれぞれの肝臓中での非結合型濃度で除することにより得られる。また、EHBRにおいても同様の検討をすることによりin vivoで観察されたグルクロン酸抱合体の胆汁排泄低下の原因についても考察した。

　SDラットにおける定常状態での両抱合体のCL_u,bile、CL_u,outflowを比較すると、グルクロン酸抱合体においてはCL_u,bileがCL_u,outflowに比べ約2倍大きいのに対し、硫酸抱合体ではCL_u,outflowがCL_u,bileの約20倍大きな値を示し、両抱合体間で胆汁と血液中への振り分けが大きく異なり、グルクロン酸抱合体では胆汁中へ、硫酸抱合体では血液(灌流液)中へ優位に振り分けられることが明らかとなった。一方、EHBRにおいては硫酸抱合体のCL_u,bile、CL_u,outflowはともにSDラットとほぼ同様の結果が得られたのに対し、グルクロン酸抱合体に対してはSDラットに比べ、CL_u,bileは約1/33に低下しCL_u,outflowが約4倍に上昇していた。この結果からEHBRにおけるグルクロン酸抱合体の胆汁排泄の低下、血液(灌流液)中への排出の増加は主に肝臓から胆汁中への排泄能の著しい低下によるものであることが示された。

　また、両ラットともにグルクロン酸、硫酸抱合体の胆汁排泄には著しい濃縮性が認められることから両抱合体の胆管側膜透過過程には何らかの能動輸送系の関与が示唆された。

　両抱合体の胆管側膜透過機構について考察するために、CMVへの取り込み実験を行った。まず、cMOATの代表的なリガンドであるジニトロフェニルグルタチオン(DNP-SG)、および胆汁酸輸送担体のリガンドであるタウロコール酸(TCA)のCMVへの取り込みについて検討したところ、これまで報告されているようにEHBRから調製されたCMVでのDNP-SGの一次性能動輸送はSDラットに比べ著しく低下しているのに対し、TCAの輸送には両ラット間で違いは見られず、EHBRにおいてはcMOATが欠損していることが確認された。E3040グルクロン酸抱合体のSDラットにおけるCMVへの取り込みはATP依存性一次性能動輸送であり、本輸送はEHBRにおいて大きく低下していることから、本リガンドもcMOATにより胆汁排泄されるものと考えられた。従って、灌流実験で得られたEHBRにおけるグルクロン酸抱合体のCL_u,bileの低下はcMOATの欠損によるものと考えられた。また、本実験においてわずかではあるがEHBRでもグルクロン酸抱合体の一次性能動輸送が観察されたことから、EHBRにはグルクロン酸抱合体を胆汁排泄するcMOATとは異なる一次性能動輸送担体が存在することが示唆された。一方、硫酸抱合体においてはATP依存性は観察されず、両ラット間でも輸送に差は認められなかった。この結果は同じ抱合代謝物であってもグルクロン酸抱合体、硫酸抱合体は異なる輸送担体により輸送されることを示唆し、抱合代謝物の胆管側膜輸送に多様性があるものと考えられた。