ヒトc-Ha-Rasは,アミノ酸189残基,分子量約21Kのタンパク質である.RasはGDP結合型(Ras・GDP)とGTP結合型(Ras・GTP)の2つの状態をとり,前者はシグナル伝達活性を持たないのに対して,後者はRaf-1,Ral-GEFs(Ral-GDS,RGL)といったターゲット分子と相互作用してシグナルを下流に伝え,最終的に細胞の増殖や分化を引き起こす.またRas・GTPはPI3-Kとも結合することも報告されている.一方でRas・GTPは負の調節因子と考えられるGAPs(p120-GAP,NF1,Gap1mなど)と結合しGTPがGDPに加水分解されてRas・GDPに戻る.

　Ras・GTPとRas・GDPの活性の顕著な差は2つの状態の高次構造の差に起因していると考えられる.したがって2つの状態の詳細な高次構造情報は,Rasの活性発現とその制御のメカニズムを理解するために極めて重要である.

　本研究では,Ras・GDPおよびRas・GTPの双方について異種核多次元NMRの手法を用いて解析を行った.まず,溶液状態におけるRas・GDPの高次構造を高分解能で決定した.次に,Ras・GTPについては,GTPの非水解アナログであるGMPPNPを結合させたRas・GMPPNPを用いて主に解析を行い,Ras・GTPの「局所的構造多形性」を初めて見い出した.またこの「局所的構造多形性」とシグナル伝達活性との相関について考察を行った.

　さらに,以上の解析と並行して,将来想定されるRas・GTPとターゲット分子のRas結合ドメインの複合体の解析のために,分子量30K程度のタンパク質(および複合体)についてのNMR法を用いた高次構造解析法の開発を行った.

図1: Ras(1-171)・GDPの水溶液における高次構造.simulated annealing法によって計算された30個の構造の主鎖を重ね合わせて表示してある.

　NMRを用いた解析には,大腸菌内での大量発現に適しており,かつ熱安定性に優れた短鎖型タンパク質Ras(1-171)を用いた.

　Ras(1-171)・GDPの主鎖シグナルの帰属は,タンパク質をユニフォームに¹³C/¹⁵Nで標識し,HNCA,HNCO,HCACO等の幾つかの3次元三重共鳴NMRスペクトルを測定し解析することで行った.側鎖シグナルの帰属は,¹³C標識試料,もしくは¹³C/¹⁵N標識試料について,HCCH-COSY,HCCH-TOCSY,HNCACB等の3次元,4次元三重共鳴NMRスペクトルを測定し解析することで行った.

　つづいて,(1)2次元および3次元NOESYスペクトルの解析から得た距離情報(2381個),(2)HMQC-J,HNHB,HN(CO)HAスペクトルの解析から得た主鎖角および側鎖₁角の2面角情報(154個),および(3)主鎖アミド基の水素結合の情報(59個)等を用い,hybrid distance geometry-dynamical simulated annealing法(DG-SA),ab initio simulateda annealing法(SA)によって高次構造計算を行った.最終的に30個の構造を計算した結果,主鎖原子についてのRMSDが0.71Å(DG-SA),0.61Å(SA),プロトン以外の全ての原子についてのRMSDが1.28Å(DG-SA),1.18Å(SA)の精度で水溶液中の高次構造を決定することができた.SA法によって決定された30個の構造の重ね合わせを図1に示す.

図2: Ras(1-171)・GMPPNPにおいて「局所的構造多形性」のために¹H-¹⁵N HSQCクロスピークの著しいブロードニングが観測される領域(黒で表示).アミノ酸残基10-13,57-64の領域はGDP/GTP結合活性およびGTPase活性に,31-39の領域はRaf-1,Ral-GEFs,GAPsなどとの相互作用に重要である.NMRによって決定されたRas(1-171)・GDPの水溶液中の高次構造の摸式図の上に示してある.

　Ras(1-171)・GMPPNPについても異種核多次元NMRを用いた同様な解析を行ない,86%の残基について主鎖シグナルの帰属を行った.ところが,ターゲット分子との相互作用に重要な「エフェクター領域」と,GDP/GTPのリン酸基の結合とGTPase活性に重要な領域を中心にした,アミノ酸残基で10-13,21,31-39,57-64,71の領域において¹H-¹⁵N HSQCピークが著しくブロードニングしていることが明らかになった(図2).この¹H-¹⁵N HSQCピークのブロードニングは,Ras(1-171)・GDPにおいては全く観測されないのに対し,Ras(1-171)・GTPおよびRas(1-171)・GTPSにおいては(程度の差こそあれ),Ras(1-171)・GMPPNPと同様に観測されたため,GTP結合型Rasに特有の性質と考えられる.

　Ras(1-171)・GMPPNPの¹H-¹⁵N HSQCスペクトルにおける,測定温度と磁場強度の依存性の解析,およびタンパク質主鎖¹⁵N核の緩和パラメータ解析の結果,前述の領域についての¹H-¹⁵N HSQCピークの著しいブロードニングは,これらの領域においてコンフォメーションが複数存在し,それぞれのコンフォメーションの間をNMRのタイムスケールに対して中程度の速度で交換しているためであることが明らかになった.またこの「局所的構造多形性」はRaf-1のRas結合ドメインとの結合によって失われることも判明した.

　Ras・GTPはRaf-1,Ral-GEFs,PI3-K,GAPsと,エフェクター領域を中心としたほとんど同一の結合インターフェイスで結合する.ところがこれらのタンパク質のRas結合領域には一次構造上のホモロジーがほとんど見当たらない.Ras・GTPにおける「動的構造多形性」は,「Ras・GTPが複数のタンパク質とほぼ同一のインターフェイスで結合できる性質」と関連があるのではないかと考えられる.すなわち,Ras・GTPでは結合インターフェイスは複数の安定な構造をとっていて,その中に,Raf-1結合型,Ral-GEFs結合型,PI3K結合型,GAPs結合型のコンフォメーションが存在するという仮説である.それに対して,Ras・GDPは,結合インターフェイスは一つの不活性な構造をとっており,したがってRaf-1,Ral-GEFs,PI3K,GAPsとは結合できないと考えられる.

　最近のNMR測定技術と解析法の進歩によって,タンパク質を均一に¹³C/¹⁵N標識し,三重共鳴NMRの手法を用いることで,150-200残基のタンパク質の詳細な高次構造決定が可能になってきている.しかし,それ以上の分子量のタンパク質のNMRを用いた高次構造解析は困難であり,たとえばRas(1-171)・GMPPNPとRaf-1のRas結合ドメインの複合体については,分子量が30Kを越えることから,現在のところ立体構造決定に到る解析は極めて困難である.

　そもそも200-300残基のタンパク質の構造決定の際に問題になる要因としては,(1)観測可能な核の総数が増大し,シグナルの分離が困難になること,(2)NOEの強度の低下(特に¹³C標識タンパク質では深刻である),の2点があげられる.本研究では,数種類のアミノ酸残基(例えば,タンパク質の疎水的コア部分を形成する,Ile/Leu/Val残基およびPhe/Tyr残基)をプロトン標識し,残りの残基を重水素化したサンプルを調製することで,シグナルの分離を容易にするとともに緩和によるNOE強度の低下を軽減することを試みた.

　アミノ酸選択的プロトン標識の有効性を調べるために,Ile/Leu/Val/Phe/Tyr残基が重水素化されたRas(1-171)・GDPの試料を数種類作成した.つづいて,これらの試料について,3次元NOESYスペクトルを測定した.NOESYの解析から得られた限られた距離情報に,,の化学シフトから得た主鎖の2面角の情報を加えて高次構造計算を行った結果,主鎖のRMSDで2-3Å程度の精度で構造を決定できた.

　アミノ酸選択的プロトン標識を用いることで,従来の構造情報の約1/3の数の距離制限からある程度の分解能でタンパク質の高次構造を決定できることが明らかになった.この方法を用いることで,NMR解析可能なタンパク質の分子量の限界を30-40Kまで引き上げることができると考えられる.