本研究は、ヒトグリオーマ細胞の増殖と悪性化に重要な役割を果たしていると考えられている、epidermal growth factor receptor(EGFR)を介するシグナル伝達機構において、EGFRを活性化するリガンドとして、ヘパリン結合性EGFファミリーに属するheparin-binding EGF-like growth factor(HB-EGF)に着目し、ヒト悪性グリオーマ細胞及び、悪性グリオーマ組織におけるHB-EGFの発現を検討し、その機能解析を行ったものであり、下記の結果を得ている。

　1.HB-EGFcDNAをプローブとしたNorther blot解析にて、検討した7種類全てのヒト悪性グリオーマ細胞株で、HB-EGFmRNAの発現が認められた。また、ヒト悪性グリオーマ(glioblastoma)組織では、非腫瘍部脳に比較し2-5倍高いHB-EGFmRNAの発現を認めた。

　2.グリオーマ細胞の細胞膜タンパクをビオチン化後、膜結合型proHB-EGFを特異的に認識する抗体を用いて免疫沈降し、HB-EGFタンパクの発現をWestem blot法を用いて解析したところ、約30kDaの膜結合型proHB-EGFに相当するバンドが認められた。以上より、グリオーマ細胞は、細胞表面に膜結合型proHB-EGFタンパクを発現していることが確認された。

　3.悪性グリオーマ組織でのproHB-EGFの発現細胞を確認するために、そのレセプターとして機能することが知られているEGFRの発現とを併せて、それぞれの特異的抗体を用いた免疫組織化学染色法で検討した。抗EGFR抗体では、腫瘍細胞が染色され、血管内皮細胞は染色されなかった。抗proHB-EGF抗体では腫瘍細胞と、血管増生の部位での血管内皮細胞、及びpericyteと思われる細胞が陽性像を示した。検討した34例の悪性グリオーマ(anaplastic astrocytoma9例、glioblastoma25例)組織中、EGFRが陽性であったanaplastic astrocytomaの3例中2例(66%)で、また、glioblastomaの13例では全例(100%)でproHB-EGFも陽性であった。さらに、EGFR陰性のanaplastic astrocytomaの2例、glioblastomaの4例においても、proHB-EGFは陽性であった。

　4.proHB-EGFは、ジャクスタクライン増殖因子として働くだけでなく、ジフテリア毒素(DT)のレセプターとしても機能していることが示されている。そこで、グリオーマ細胞で発現が確認されたproHB-EGFがDTのレセプターとして機能するかを、DT投与後のタンパク合成阻害能を指標に検討した。10ng/mlのDT投与によりproHB-EGFを発現しているグリオーマ細胞のタンパク合成能は、DT未投与のコントロール細胞の約20%まで阻害された。また、proHB-EGFの発現がないmouse L cellでは、DTによるタンパク合成阻害能は認められなかった。以上の結果は、proHB-EGFがDTレセプターとしても機能しうるというこれまでの報告に矛盾しないものであった。

　5.グリオーマ細胞に対し、HB-EGFは増殖活性を有し、またオートクライン増殖因子として機能しうるかを検討した。血清除去下で培養したグリオーマ細胞に、種々の濃度でrecombinant HB-EGF(rHB-EGF)を投与した結果、濃度依存性に細胞増殖増強効果が認められ、10ng/mlのrHB-EGF投与では、未投与のコントロール細胞に比較し、細胞数が約2倍に増加することがわかった。一方、HB-EGFに対する特異的な中和抗体を加えると、コントロールのIgGを加えたものに比較し、約30-40%の細胞増殖抑制が認められた。以上の結果より、HB-EGFはグリオーマ細胞に対して増殖活性を有し、オートクライン増殖因子として機能していることが明らかとなった。

　basic FGF(bFGF)及びEGFは、グリオーマ細胞に対して増殖因子として働くことが示されている。そこで、これらのグリオーマ細胞に対する増殖活性をDNA合成能を指標にHB-EGFのそれと比較した。10ng/mlのrHB-EGFの投与は、5%血清投与に比べると、1.2-2.3倍程度、グリオーマ細胞でのDNA合成能を促進することがわかった。rHB-EGFのもつDNA合成促進能は、10ng/mlのEGF,bFGFに比較すると、10-20%とわずかながら高かった。

　6.グリオーマ細胞におけるHB-EGFの発現が、HB-EGF自体、あるいは他の増殖因子による発現制御を受けるかを、T98G細胞を用いて検討した。rHB-EGF投与により、またEGF,TGF等のEGFファミリーに属する増殖因子、さらに他のファミリーに属するbFGF投与によっても、HB-EGFmRNAの発現が投与3-6時間後をピークに誘導された。

　7.血管内皮特異的な増殖因子であるvascular endothelial growth factor(VEGF)は、グリオーマの血管新生に重要な役割を果たしていることが示されている。HB-EGFは、直接内皮細胞に対して増殖活性をもたないが、VEGFを誘導できれば、間接的に血管新生に関与すると考えられる。そこで、rHB-EGFをグリオーマ細胞に投与し、VEGFが誘導されるかを検討した。10ng/mlのrHB-EGFを投与すると、検討した3種のグリオーマ細胞株でVEGFmRNAの発現が亢進することがわかった。また、このVEGFmRNAの発現誘導は、加えるrHB-EGF濃度依存性に増加した。さらにrHB-EGFによるVEGFmRNAの発現誘導は、培養液中へのVEGFタンパク分泌促進につながることが、VEGF抗体を用いたWestem blot解析の結果より確認された。

　以上、本論文はHB-EGF及びproHB-EGFがヒト悪性グリオーマ細胞、腫瘍組織で発現しており、TGFやbFGF等の増殖因子とシグナル伝達のネットワークを構築しながら、オートクライン、或いはジャクスタクライン増殖因子として腫瘍細胞の増殖に深く関与していること、HB-EGFはグリオーマ細胞に対し、VEGF産生の増強作用をもつことから、腫瘍細胞の増殖のみならず、血管新生にも関与する可能性があることを明らかにした。本研究は悪性グリオーマ細胞の増殖、腫瘍血管新生のメカニズムの解明に重要な貢献をなすと考え、学位の授与に値するものと考えられる。