マウス臓器より血管内皮細胞を分離培養する方法を確立した。肝血管内皮細胞はマウス門脈より酵素液を灌流の後、肝臓を摘出、細切して酵素液にて溶解し、密度勾配遠心にて分離した。肺血管内皮細胞は同様に下大静脈より酵素液を灌流ののち肺を摘出、溶解し、ナイロンメッシュを用いて分離した。

　マウス肝、肺より血管内皮細胞を分離培養し、同定した。いずれの細胞も通常のMEM培地にウシ胎児血清(FBS)10%を加えた条件で良好な増殖を示し、敷石状に増殖する単層培養を形成して、継代培養可能であった。

　尾静脈内移植、脾臓内移植による転移実験において異なる転移性を示す2種類の腫瘍細胞(神経芽細胞腫)と同系マウス肝臓より分離培養した肝血管内皮細胞単層培養を用いて実験を行った。

　接着実験はコンフルエントな血管内皮細胞単層培養上に腫瘍細胞を撒き、一定時間回転によるshear stressを加えながら培養の後、培地を捨てて洗浄し、付着した腫瘍細胞を比較した。浸潤実験は同様に腫瘍細胞を撒いた後、腫瘍細胞が浸潤していく過程を観察し、2種類の細胞の浸潤性を比較した。

　早期継代の血管内皮細胞株を用いた接着実験で、脾臓内移植後の肝転移性と腫瘍細胞の血管内皮細胞への接着性が相関する結果であった。継代数が10継代目になると接着性が低下し、異なる腫瘍細胞間の接着性の有意差が消失した。浸潤性は2つの細胞株で有意差を認めなかった。

　早期継代血管内皮細胞は臓器内における血管内皮細胞の性質を反映していると考えられ臓器特異的転移について研究する上で重要な役割を果たすものと考えられた。腫瘍細胞の血管内皮細胞に対する接着性がin vivoでの腫瘍の転移性に関与していると考えられた。

　第II章と同様に、コンフルエントな肺血管内皮細胞単層培養を用いて腫瘍細胞との接着実験、浸潤実験を施行して、肝血管内皮細胞の実験結果と比較した。接着因子(VCAM-1,ICAM-1)に対する抗体を用いて、接着阻害実験を施行し、腫瘍細胞と肝血管内皮細胞の接着に関与する接着因子について検討した。

　免疫染色にて血管内皮細胞上の接着因子の発現を確認した。

　肝に臓器特異的転移性を示す腫瘍細胞と肝由来、肺由来血管内皮細胞の接着性を比較したところ、早期継代血管内皮細胞株では、肝血管内皮細胞が有意に高い接着性を示した。

　浸潤性では有意な差は認めなかった。接着性が臓器特異的転移性に関与していると考えられた。肝血管内皮細胞と腫瘍細胞の接着はVCAM-1に対する抗体で阻害され、血管内皮細胞表面のVCAM-1が腫瘍細胞との接着に関与していると考えられた。肝血管内皮細胞のVCAM-1の免疫染色では10継代目では染色性が低下し、接着実験の結果と合致する結果であった。

　マウス肝臓より肝細胞とKupffer細胞を分離培養し、培養上清を血管内皮細胞単層培養に加えて一定時間の後に接着実験を施行し、血管内皮細胞と腫瘍細胞との接着性の変化を検討した。同様に各種サイトカインを血管内皮細胞に加えて、接着性の変化を比較した。

　肝細胞、Kupffer細胞の培養上清は腫瘍細胞の肝由来血管内皮細胞に対する接着性を有意に上昇させた。この接着性の上昇は抗IL-1抗体で用量依存的に阻害され、培養上清中のIL-1が接着性上昇に関与していると考えられた。リコンビナントIL-1は肝由来血管内皮細胞の接着性を著明に上昇させたが、肺由来血管内皮細胞の接着性はわずかに上昇させただけであった。生体内において、肝血管系の接着因子の発現が周囲の肝細胞、Kupffer細胞よりのIL-1を含むparacrineな因子により上昇、維持されている可能性がある。

　ヒト骨肉腫細胞を低酸素下と通常酸素濃度下で培養し、それぞれ培養上清を回収して、第II章で分離培養したマウス肝由来血管内皮細胞に加え、血管内皮細胞の増殖を比較した。つぎに、同様に低酸素下と通常酸素下で培養した腫瘍細胞をグアニジン溶液を用いて融解し、RNAを回収して、RT-PCR法にてmRNAレベルにおけるVEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)の発現を比較した。

　低酸素下培養の培養上清を加えた培地は、通常酸素下培養やコントロールの培地と比較して有意に高い血管内皮細胞増殖活性を示した。RT・PCR法では、低酸素状態で培養した腫瘍細胞は通常酸素下培養と比較して、約8倍のVEGFmRNAの発現が認められた。

　低酸素状態において腫瘍細胞がVEGFを分泌し、血管内皮細胞の増殖に関与している可能性がある。