ハイマンノース型糖鎖をもつMSGをエンドグリコシダーゼFで処理したところ糖鎖に相当すると考えられる分子量の低下が認められた。この糖鎖をはずしたMSGを抗原として抗体を作製し反応性を確認したところ、ペプチド部分に反応することが確認された。

　MSGの1次構造を明らかにするため、上記の抗体を用いイムノスクリーニングによってMSGcDNAをクローニングした。得られた複数のクローンの塩基配列を解析したところ、意外なことに、塩基配列はクローン間で一致しなかった。しかしながら、DNAレベルで約80%の類似性を有することからみて、いずれのクローンもMSGをコードするものと考えられ、このことはノーザンブロット解析などによっても支持された。すなわち、MSGcDNAは多型なサブタイプで構成されるcDNAのファミリーであることが明らかとなった。推定されるアミノ酸レベルでの相同性はサブタイプ間で約70%であった。詳しく解析を進めたところ、MSGcDNAは全長が約4kbで、ほとんどの領域にサブタイプ間の多型性が認められるが、5’末端の約400bPの配列のみはサブタイプ間で完全に保存されていることが判明し、本保存配列をUCS(Upstream Conserved Sequence)と命名した。

　MSGcDNAには多型性が認められたことから、これらをコードするMSG遺伝子にも多型が認められるものと予測され、遺伝子多型についても明らかにすべくMSGゲノム遺伝子について解析を進めた。予測通りゲノム上にはcDNA多型を説明するに十分と考えられる多型多重なMSG遺伝子が存在していた。ところが、MSG遺伝子の塩基配列を決定してみると、これらのMSGゲノム遺伝子はcDNAの5’末端に保存されたUCSを持たないことが明らかとなった。UCSはcDNAの5’末端に保存されていることから、UCSを持つMSG遺伝子こそが発現遺伝子と考えられた。そこで、UCSのゲノム上の存在を明らかにすべく、UCSをプローブとしてパルスフィールド電気泳動により染色体DNA解析行った。その結果、UCSは、約14本のP.cariniiの染色体の内、500kbの長さの1本の染色体にのみ存在していることが明らかとなった。この結果は、MSGの多型領域がほとんどの染色体上存在しているという結果とは大きく異なっていた。そこで、サザンブロット解析でUCSのコピー数を検討したところ、MSG遺伝子は多型多重であるのに対し、UCSは1コピーしか存在しないことが示唆された。以上の結果は、ゲノム上に存在する多型多重なMSG遺伝子のほとんどは非発現遺伝子であり、MSG発現部位はUCSの存在する一箇所であることを示している。発現クローンであるMSGcDNAが多型であったことを踏まえると、ゲノム上たった一箇所のMSG発現部位から多型なMSGが発現していることを示している。

　MSGの発現部位が一つであるにも関わらずP.carinii集団内でMSGRNAが多型となるメカニズムを探るため、UCSを持つ発現部位のゲノムクローンを複数解析したところ、各クローンにおいてUCSは異なるMSG多型領域に直結していた。すなわち、cDNAに認められた[UCS-多型領域]とつながる構造がDNAレベルでも認められたことになり、多型MSGの発現にはたらく調節はDNAレベルで起きていることが明らかとなった。ゲノム上にはプールと考えられる非発現MSG遺伝子が多数存在することから、この調節はDNA組換えである可能性が高いものと考えられた。

　組換えに関与するMSG遺伝子のゲノム上の位置をさらに追究した結果、組換え部位であるMSG発現部位は、500kbの染色体上のテロメア近傍に位置していた。MSG発現部位の下流にはサブテロメアと考えられる繰り返し配列と、TTAGGGというテロメア配列の繰り返しが存在している。一方、発現部位以外のサイレントなMSG遺伝子はゲノム上にタンデムなクラスターを形成し、少なくともその一部がテロメア近傍に位置している。

　総合的にみて、MSG発現クローンの多型は発現部位におけるプログラムされたDNA組換えによってつくり出されており、多型多重のサイレントなMSG遺伝子は、この遺伝子スイッチと遺伝子プールの保持とにはたらいている可能性が高いものと考えられる。

　UCSはcDNAの5’領域に保存されていたことから、ゲノム上のUCSが発現部位と考えられたが、分類学的に近縁な酵母でUCS上流領域がプロモーターとして機能し得るかを検討した。その結果、プロモーター活性が認められ、UCS部位がMSGの発現部位であることが支持された。

　遺伝子スイッチにはたらくメカニズムのモデルを、多数のMSG遺伝子の塩基配列の比較に基づき組み立てた。第1に、発現部位MSG遺伝子とサイレントなMSG遺伝子の塩基配列を比較すると、サイレントなMSG遺伝子はUCSのほとんどを持たないが、最も多型領域に近い28bpのみは保持していた。この配列をCRJE(Conserved Recombination Junction Element)と呼ぶが、CRJEのみは発現部位とサイレントなMSG遺伝子間で保存されていることから、発現部位のCRJEにおける部位特異的組換えにより、下流の多型領域が組換わっている可能性が高いものと考えられた(モデル1)。第2に、MSG遺伝子およびcDNAの多型領域の塩基配列に注目して比較を行ったところ、「キメラ」クローンが見つかった。「キメラ」クローン間では、類似性を示す部分と塩基配列が完全に一致している部分が存在していた。このようなクローンが見つかったことは、多型領域内の塩基配列の類似性に基づく相同組換えが起きていることを示唆するものと考えられた(モデル2)。モデル1及び2は協調的にはたらきあっている可能性が高い。これらのモデルに示したメカニズムにより、P.carinii集団のMSGがアミノ酸レベルで高度に多型になっているものと考えられる。

MSG遺伝子スイッチのモデル