チーズ製造の第一段階である凝乳工程には、凝乳酵素(レンネット)と呼ばれるアスパラギン酸プロテアーゼが用いられてきた。凝乳酵素は牛乳中のミセル保護に寄与している-カゼインに働いて、100余りのアミノ酸残基からなるポリペプチド鎖のただ1箇所存在するPhe¹⁰⁵-Met¹⁰⁶のペプチド結合を特異的に切断し、ミルクを凝固させる。凝乳酵素は、-カゼインに対して高い基質特異性と低いプロテアーゼ活性を示すという特徴を兼ね備えていることが必須であり、数多くのプロテアーゼの中でも凝乳酵素と呼ばれるものはごくわずかに過ぎない。

　チーズ製造に利用され、酵素学的にも長い歴史をもつキモシンは、生後1〜2週間の子ウシの第4胃からのみ採取される。しかし、近年の世界的な肉需要の増大に伴ってキモシンの供給不足が深刻となり、代替凝乳酵素を他の生物資源に求める研究が行われた。1967年、Arimaらにより約1,000株におよぶ土壌分離菌のスクリーニングの結果、毛カビに属するRhizomucor pusillus(以前は、Mucor pusillusに分類されていた)が分泌するアスパラギン酸プロテアーゼであるムコールレンニン(以下MPPと略す)が凝乳酵素として見出された。チーズの製造試験の結果、ムコールレンニンを用いて作製したチーズはキモシンを用いた場合と同等の商品価値を持ち、かつ工業規模でも充分製造可能であることが確認された。R.pusillus由来レンニンに加え、R.mieheiの生産するレンニンも工業的に実用化され、これら代替凝乳酵素は、現在世界のチーズ製造に広く利用されている。

　本論文ではまず毛カビRhizomucor pusillus IFO4578株よりクローニングされたMPP遺伝子を黄麹菌Aspergillus oryzaeに導入し、組換え発現したMPP蛋白質の糖鎖の解析を行った。MPP遺伝子のDNA塩基配列から推定されるアミノ酸1次配列上には、3カ所のアスパラギン結合型糖鎖付加部位(Asn⁷⁹-Ile-Thr,Asn¹¹³-Val-Ser,Asn¹⁸⁸-Asn-Thr)が存在する。酵母Saccharomyces cerevisiaeの発現系を用いた解析結果からはAsn⁷⁹およびAsn¹⁸⁸の2個所にアスパラギン結合型糖鎖が付加されていることが示されているが、黄麹菌を宿主に発現させた場合も同じアスパラギン残基に糖鎖が付加されていることが判った。また、黄麹菌由来MPPは酵母由来MPPと同じくR.pusillus IFO4578株が産生するMPPよりも過剰にマンノースが付加された糖鎖を有していた。酵母発現系においては、MPPに付加されたアスパラギン結合型糖鎖の本数が増えるに従い凝乳活性が低下し逆にプロテアーゼ活性が上昇した。一方本実験では、発現宿主を変えることによりマンノース含量の異なる糖鎖を持つMPPが得られたことから、糖鎖の大きさがMPP酵素活性に与える影響について検討した。その結果、マンノース含量が多く糖鎖が大きいほど凝乳活性が低下し逆にプロテアーゼ活性が上昇することが判った。いずれの実験結果においても糖鎖を持たないMPPおよび市販のMPPは糖鎖を有するMPPよりも凝乳活性が高くプロテアーゼ活性は低かった。以上のようにMPPに付加されたアスパラギン結合型糖鎖はその凝乳活性やプロテアーゼ活性などの酵素活性に大きく影響を与えていることが判った。

　次に市販のMPPにはほとんど糖が含まれていないという知見を基に、分泌されたMPPの分子量の低下を指標に研究室保存株を検索した結果、市販のMPPと同程度まで分子量が低下したMPPを分泌する株R.pusillus No.1116を見出した。SDS-ポリアクリルアミド電気泳動解析より、No.1116株は3種のMPP分子を分泌していることが示された。糖鎖遊離酵素の基質特異性や、レクチンとの結合性、糖組成分析などの分析結果から、No.1116株の分泌する3種のMPP分子のうち、分子量の大きな2分子については小型の糖鎖(Man_0〜1GlcNAc₂)が付加されていることが判った。また最も分子量の小さなMPP分子には全く糖が付加されていないことが判明した。さらに、糖鎖プロセッシング酵素阻害剤を用いた解析や細胞融合法による変異形質の遺伝解析の結果から、この小型の糖鎖(Man_0〜1GlcNAc₂)はMPP蛋白に付加された糖鎖が切断されて生じたのではなく、小型の糖鎖が直接MPP蛋白に転移された結果であることが示唆された。したがって、このアスパラギン結合型糖鎖付加変異株No.1116は、アスパラギン結合型糖鎖の前駆体である糖結合型ドリコールの生合成経路に変異が生じた株であると類推される。酵母においても同様な小型の糖鎖が転移される変異株(alg1,alg2)が取得されているが、これらの変異株が温度感受性変異株であるのに対し、本研究で見い出されたR.pusillus No.1116株の変異形質は条件致死変異ではない点、大変興味深い。また前述のようにMPPは糖含量が減少するに従い、プロテアーゼ活性が低下し逆に凝乳活性が上昇するという、凝乳酵素として好適な条件が高まる。市販MPPの産生株は本実験で示したNo.1116株とは同じ株ではないが、両株ともR.pusillus F27の派生株であることから、アスパラギン結合型糖鎖付加における遺伝的背景は同じである可能性は高い。従って、市販MPPの産生株においてアスパラギン結合型糖鎖に変異が生じてMPPの糖含量が低下したのは、凝乳活性の上昇を指標に変異操作を繰り返した結果によるものなのかも知れない。

　酵母や黄麹菌などの宿主を用いたMPPの発現研究から、R.pusillus IFO4578株の産生するMPPにはMan₅GlcNAc₂分子程度の比較的小型のアスパラギン結合型糖鎖が付加されていることが推定された。そこで、アルカリ条件下におけるMPP自己消化反応を利用して、Asn⁷⁹およびAsn¹⁸⁸に付加されたアスパラギン結合型糖鎖を含む糖ペプチドを別々に分離精製した。N-Glycanaseにより両糖鎖を切り出した後、ピリジルアミノ化標識してHPLCにより分析した。サイズフラクショネーションHPLCおよび逆相HPLC分析を用いた2次元マップ解析から、R.pusillus IFO4578株由来MPPのAsn⁷⁹にはMan₅GlcNAc₂、Asn¹⁸⁸にはMan₅GlcNAc₂およびMan₆GlcNAc₂のアスパラギン結合型糖鎖糖鎖が付加されていることが明らかとなった。これらの糖鎖は動物細胞由来のハイマンノース型糖鎖にも見られる構造であることから、R.pusillusは動物細胞由来糖蛋白質の発現宿主として有望であると考えられる。

　毛カビRhizomucor pusillusが分泌するムコールレンニン(以下MPPと略す)は、チーズ製造における凝乳酵素として実用化されており、牛乳中のミセル保護に寄与している-カゼインに1箇所存在するPhe¹⁰⁵-Met¹⁰⁶のペプチド結合を特異的に切断し、ミルクを凝固させる。本論文ではMPPについて分子生物学的、生化学的手法を用い、付加された糖鎖と酵素活性の関連およびその糖鎖の構造を明らかにしている。また、R.pusillusにおいて糖鎖付加変異株を見い出し、生化学的、遺伝学的解析法を用いて、その変異形質を明らかにしている。