Na/K-ATPaseは主に犬腎よりHayashiらの方法により精製した。ATPase活性はATPの加水分解によって遊離したリン酸をFiske-Subbarow法で定量することにより測定した。Na-Na、Na-K交換輸送反応は赤血球をもちいてGarrahanとGlynnの方法で、K-K交換輸送反応は赤血球ゴーストをもちいてSimonsの方法で測定した。イオン等のリガンドの結合はMatsuiとHomaredaによって開発された遠心法により測定した。リガンド存在下でのATPaseのトリプシン限定分解はJorgensenの方法にしたがっておこない、その分解パターンをSDS-PAGEにより観察した。

　Na/K-ATPase活性、イオン輸送およびイオン結合量におよぼすオリゴマイシンの影響-オリゴマイシンのNa/K-ATPase活性やイオン輸送に対する作用については既に多くの報告がなされてきたが、結合部位についての情報は少ない。そこで、オリゴマイシンの特異的結合部位が単一であるか複数であるかを推定する目的で、ATPase活性、イオン輸送ならびにイオン結合にあたえるオリゴマイシンの効果を直接比較検討した。オリゴマイシンによるATPase活性の半阻害濃度()は2.2Mであった。また、この薬剤はNa-KおよびNa-Na交換輸送反応を各々＝1.2Mおよび1.4Mで阻害したが、K-K交換輸送反応には影響を与えなかった。さらに、オリゴマイシンの添加によって、Na/K-ATPaseへのNa⁺結合は最大約6倍に増大したが、K⁺結合には影響がなかった。Na⁺の結合量を最大結合量の半分まで増大させるオリゴマイシン濃度()は4.5Mであった。オリゴマイシンによるATPase活性およびNa⁺輸送活性の阻害曲線ならびにNa⁺結合の促進曲線はすべて一相性であり、これらのならびにが近似した値を示したことから、この薬剤の特異的結合部位は反応速度論的に一種類であると考えられた。

　イオン結合の親和性にあたえるオリゴマイシンの影響-オリゴマイシン存在下、非存在下でのNa/K-ATPaseへのNa⁺結合の解離定数は各々150Mと500Mとなり、オリゴマイシンがNa⁺の親和性を増大させることが明らかになった。しかし、K⁺結合の解離定数はオリゴマイシン存在下で5.5M,非存在下で4.0Mとなり、この薬剤はK⁺の親和性には影響を与えなかった。このことをさらに確認するため、種々のリガンド存在下K⁺結合に対するオリゴマイシンの影響を調べた。ATP、PiおよびMg²⁺を単独またはリン酸化中間体を形成する条件でオリゴマイシンと共に加えても、K⁺の結合量は変化しなかったが、これらリガンドにNa⁺を添加したときにはK⁺の結合量は低下した。Na⁺結合とK⁺結合は互いに阻害しあうことから、オリゴマイシンがNa⁺結合の親和性を増大させたことによって、K⁺結合が低下したと考えられた。

　Na/K-ATPaseのコンホメーションにあたえるオリゴマイシンの影響-オリゴマイシンがNa/K-ATPaseのコンホメーションを特異的な型に誘導するか否かを調べるために、Na⁺、K⁺、ATP、ウワバインまたはオリゴマイシン存在下でのATPaseのトリプシン限定分解パターンをSDS-PAGEで観察した。オリゴマイシン存在下での分解パターンは緩衝液のみが存在したときの分解パターンと類似していたが、Na⁺、K⁺、ATPまたはウワバイン存在下のパターンとは異なっていた。また、これらのリガンドとオリゴマイシンを同時に存在させても、分解パターンは変わらなかった。それゆえ、オリゴマイシンはコンホメーション変化を介することによって、その特異的作用を発現するのではないと考えられた。

　ATPおよびウワバイン結合にあたえるオリゴマイシンの影響-オリゴマイシンはNa/K-ATPaseの細胞質側に結合部位があるATPの結合にほとんど影響をあたえなかったが、細胞の外側に結合部位があるウワバインの結合を阻害した。もちいたウワバイン濃度に対し半阻害に要するオリゴマイシン濃度をプロットしたところ、この二つのパラメーター間に直線関係は成り立たず、オリゴマイシンによるウワバイン結合阻害は競合阻害ではないこと、すなわち結合部位が異なることが示唆された。これを確認するために、ラット腎由来のウワバイン低感受性Na/K-ATPaseアイソフォームならびに犬腎由来の高感受性アイソフォームのATPase活性に対するオリゴマイシンの影響を調べたところ、この薬剤はいずれもI₅₀＝2.2Mで同様に阻害した。これらアイソフォーム間のH1-H2のアミノ酸配列の違いがウワバイン感受性の違いの原因であることから、この部分がオリゴマイシンの感受性に影響をあたえないことが明らかになった。さらに、オリゴマイシンは細胞の外側からNa/K-ATPaseに作用するというCorneliusとSkouの結論とあせて考えると、オリゴマイシンの結合部位は細胞膜外側であるがウワバインの結合部位とは異なることが示唆された。

図2Na/K-ATPaseのイオン輸送モデル

　オリゴマイシンは、Na/K-ATPase活性やNa⁺輸送を阻害する一方Na⁺結合を増大させたが、K⁺輸送やK+結合には影響をあたえなかった。オリゴマイシンによるATPase活性ならびにNa-K、Na-Na交換輸送のI₅₀やNa⁺結合量を増大させるK_0.5の値が近似していることから、この薬剤の特異的結合部位は一種類であることが示唆された。また、オリゴマイシンはATPaseのコンホメーションに影響をあたえなかったので、もっと直接的な機構でその特異的作用を発揮していると考えられる。つまりNa/K-ATPaseの細胞外側からNa⁺の遊離部位またはその近傍に結合し、Na⁺の遊離を直接阻害することによって見かけ上Na⁺の結合量を増大させ、occluded formを安定化させているのではないかと考えられる。これらをふまえて図2に示したようにNa⁺とK⁺の輸送路が異なっているというモデルを提唱した。