ラット(6週齢)にrhG-CSFを10,100および1,000g/kgの用量で28日間反復静脈内投与した。白血球数の増加、髄外造血の亢進に伴う脾臓の腫大および骨髄における顆粒球系細胞の増加に伴うcellularityの上昇などの造血系の変化は、10g/kg以上の群に用量依存性にみられた。100g/kg以上の群では、造血系の変化に加え、骨にも用量依存性の変化が認められた。すなわち、骨幹端および骨端の海綿骨骨梁ならびに骨幹の皮質骨骨内膜部など、生理的に活発な骨吸収が行われている部位に、破骨細胞性骨吸収の亢進と膜内骨化による骨形成を特徴とする骨変化が認められた。破骨細胞性骨吸収はほとんどすべての部位に認められ、そのうち約半数の部位では骨吸収に加えて骨形成が認められた。これらの結果より、高用量のrhG-CSFは造血系とともに骨に作用し、生理的に骨吸収の盛んな部位に形態変化を誘導することが明らかになった。

　6週齢の成長期ラットと成長の緩やかな14週齢のラットに、rhG-CSFを100およびl,000g/kgの用量で28日間反復静脈内投与した。6週齢ラットでは、100g/kg以上の群の骨幹端、骨端および骨幹に骨の変化が認められた。一方、14週齢ラットでは、1,000g/kg群にのみ変化が認められ、また、骨変化は骨幹端に限局していた。骨変化の組織学的特徴に週齢による差はみられなかったが、骨変化の程度を病理組織学的に比較した結果、6週齢群が14週齢群より高値を示した。これらの結果より、rhG-CSF投与により骨吸収および骨形成を特徴とする骨変化が週齢に関係なく形成されるが、成長期にある6週齢ラットは成長の緩やかな14週齢ラットに比べて骨変化が形成されやすく、rhG-CSF投与に伴う骨変化の形成には骨の生理的状態、特に、骨吸収活性が深く関与することが明らかになった。

　ラット(14週齢)に1,000g/kgのrhG-CSFを28日間反復静脈内投与した。骨髄では顆粒球系細胞の増加に伴うcellularityの上昇が認められ、いずれの骨も対照群に比べて高いcellularityを示した。骨変化は活発に造血が営まれている骨髄を有する骨にのみ認められた。したがって、rhG-CSF投与に伴う骨変化は骨髄造血状態と密接に関連しており、また、活発な造血を営む骨髄内では高用量のrhG-CSF投与により破骨細胞への分化能を有する前駆細胞が多数供給されるものと考えられた。

　骨変化の形成過程を経時的に観察するとともに、破骨細胞性骨吸収を強力に抑制するビスフォスフォネート(BP)を前処置し、rhG-CSFによって誘導される骨変化における骨吸収と骨形成との関連について検討した。まず、ラット(6週齢)に1,000g/kgのrhG-CSFを1〜28日間反復皮下投与した。その結果、骨吸収の亢進が投与3日後から、また、骨形成が投与7日後から、それぞれ認められ、いずれも投与期間が長くなるに従い増強した。また、骨吸収が骨形成の発現頻度を常に上回っていた。骨変化は、生理的に活発な骨吸収が行われている部位に観察され、初期には主に骨幹端に、その後、投与期間が長くなるに従い、骨端および骨幹にも認められた。ついで、ラット(6週齢)にBPを前処置した後、1,000g/kgのrhG-CSFを14日間反復皮下投与した。その結果、BPの前処置により、破骨細胞性骨吸収の抑制とともに膜内骨化による骨形成も抑制された。以上の結果より、rhG-CSF投与による骨変化の病理発生に関しては、破骨細胞性骨吸収の亢進が先行し、その後、カップリング機構に基づく膜内骨化による骨形成が起こるものと考えられた。

　ラット(6週齢)に1,000g/kgのrhG-CSFを4〜28日間反復皮下投与し、骨髄間質細胞の構成・分布および細胞動態、ならびに細胞外マトリックスの構成・分布の変化を検索した。骨吸収部周辺の間葉系組織内には、破骨細胞および酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ(TRAP;破骨細胞マーカー酵素)陽性を示す単核の破骨細胞前駆細胞が多数認められた。ブロモデオキシウリジン(BrdU)を用いた細胞動態の解析の結果、破骨細胞は投与開始初期には分化・成熟期の細胞から供給され、その後、増殖期の細胞からも供給されていた。破骨細胞が多数存在する吸収骨近辺の間葉系組織内には、ED-1(単球/マクロファージ/樹状細胞系マーカー抗原)陽性、酸ホスファターゼ(ACP)陽性およびED-2(マクロファージマーカー抗原)陰性の細網細胞様細胞が密に、また、アルカリホスファターゼ(ALP)陽性および/あるいは-平滑筋線維アクチン(-SMA)陽性の線維芽細胞様細胞が散在性に、それぞれ認められた。BrdUを用いた細胞動態の解析より、これらの細胞の多くはrhG-CSF投与開始後に増殖・分化していた。細胞外マトリックスの分布については、フィブロネクチン(FN)、1型コラーゲン(Coll I)およびヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)が間質細胞間に網の目状に広く認められ、骨組織に接することなく存在する破骨細胞およびTRAP陽性単核細胞を取り巻くように観察された。IV型コラーゲンおよびラミニンは主に小血管周囲にみられ、破骨細胞との間に明瞭な関連は認められなかった。以上の結果より、高用量のrhG-CSF投与に伴い骨髄間質細胞および細胞外マトリックスの構成・分布が変化し、破骨細胞の形成および活性化を亢進する骨髄微小環境が構築されるものと推察された。また、骨髄間質細胞では、ED-1陽性、ACP陽性およびED-2陰性の細網細胞様細胞、ならびに、ALP陽性および/あるいは-SMAの線維芽細胞様細胞が、また、細胞外マトリックスではFN、Coll IおよびHSPGが、それぞれ破骨細胞の形成・活性化を亢進する骨髄微小環境の構築に重要な役割を果たしているものと考えられた。

　M-CSFの産生欠乏により大理石骨病を起こすop/opマウス(5週齢)に、rhG-CSFを10,100,1,000および10,000g/kgの用量で28日間反復皮下投与し、骨病態の変化を検討した。その結果、rhG-CSF投与群で用量依存性に一次海綿骨長軸長の短縮が観察された。破骨細胞数およびその分布については、rhG-CSF投与群とop/opマウス対照群との間に明確な差は認められなかった。rhG-CSF投与によりop/opマウスの骨病態が一部改善されたことより、G-CSFはM-CSFの関与しない機構で骨への作用を有するものと推察された。また、破骨細胞の分布に変化をきたすことなく骨病態が改善したことから、op/opマウスの特徴である加齢とともに骨病態が自然治癒する現象にG-CSFが関与している可能性が示唆された。

　以上、本研究により、高用量のrhG-CSFは造血系とともに骨に作用し、骨幹端など生理的に破骨細胞の働きが盛んな部位に破骨細胞性骨吸収の亢進と膜内骨化による骨形成を特徴とする形態変化を起こすことが明らかにされた。また、骨変化の病理発生について、破骨細胞性骨吸収の亢進が先行し、その後、カップリング機構に基づく骨形成が起こることが初めて示された。さらに、rhG-CSFの骨への作用機構については、高用量のrhG-CSFが顆粒球(好中球)系細胞とともに破骨細胞系細胞の供給を亢進させ、同時に、骨髄間質細胞および細胞外マトリックスの構成・分布を変化させて、破骨細胞の形成および活性化を亢進する骨髄微小環境を構築することが明らかにされた。このように、本研究の成果は、G-CSFによる、より普遍的な骨および骨髄の形態および機能の調節機構を明らかにしていく上で極めて重要であると考えられる。