破骨細胞は、骨表面に類骨層が存在した状態では骨基質の吸収ができず、その類骨層の破壊にはtype Iコラゲナーゼが必要であることから、骨芽細胞の産生するtype Iコラゲナーゼが骨吸収に重要な役割を果たしている可能性が示唆されてきている。そこでまず、H-31細胞とヒト骨芽細胞様細胞MG63細胞のcocultureを行い、培養上清中のtype Iコラゲナーゼ活性を測定した。その結果、両細胞をcocultureすることにより顕著な活性の増加が認められた。次に、各細胞の単独培養上清を他方の細胞に添加しその培養上清中の活性を測定することにより、H-31細胞由来の液性因子がMG63細胞のtype Iコラゲナーゼ産生を促進していることが明らかとなった。この結果は、癌細胞としてMDA-MB-231細胞、骨芽細胞としてマウス骨芽細胞MC3T3-E1細胞を用いた場合にも同様に認められた。

　次に、この骨芽細胞の産生するtype Iコラゲナーゼの同定を行ったところ、マトリックスメタロプロテアーゼであるMMP-1であることが明らかとなった。H-31細胞の培養上清は、MG63細胞に作用しMMPのinhibitorであるTIMP-1,2の産生も促進させることが判明したが、コラーゲンコート上にMG63細胞を培養しH-31細胞の培養上清を添加すると、コラーゲンの遊離が促進されることより、totalとしてのコラーゲン分解活性が上昇していることが明らかとなった。また、器官培養系を用いた骨吸収活性の検討において、H-31細胞培養上清によるCa遊離作用は、MMPのinhibitorであるminocyclinにより抑制された。

　これらの結果より、骨髄腔に侵入した溶骨性癌細胞は、骨芽細胞からのMMP-1産生を促進し、類骨層の分解を引き起こすことにより、破骨細胞による骨吸収を促進させている可能性が示唆された。

　骨芽細胞による類骨層の破壊に次ぐ癌細胞の挙動を検討するために、H-31細胞およびMDA-MB-231細胞のコラーゲンおよびその分解物への走化作用について検討を行った。まず、chemotaxis assay系においてコラーゲンをトランスウエル下層に添加し、癌細胞の走化性について検討したところ、コラーゲンの濃度依存的に走化性が認められた。次いで、コラーゲンコートした下層に骨芽細胞を培養した後、上層に癌細胞を添加し走化性を検討した結果、骨芽細胞を培養していない場合に比べ顕著なchemotactic responseが観察された。

　これらの結果より、溶骨性癌細胞は骨芽細胞による類骨層の分解を促進させるとともに、その結果、分解・遊離したコラーゲンヘ走化性を示すことにより、骨基質内へ浸潤していく図式が考えられた。

　上述したように、溶骨性癌細胞のin vivo骨転移像およびマウス頭頂骨を用いた骨吸収活性測定系においては、明瞭な破骨細胞像の出現が観察される。そこで、破骨細胞の分化・形成における溶骨性癌細胞の関与について検討を行った。

　まず、癌細胞自身が、破骨細胞形成に関わる幾つかの因子をどの程度産生しているかについて検討を行ったが、いずれの細胞も、若干のIL-1,GM-CSF,M-CSF等の産生がみられたのみで、破骨細胞の形成促進に関わると考えられるほど高濃度の破骨細胞形成因子は認められなかった。

　幾つかの破骨細胞形成因子は、骨芽細胞がその産生能を有していることが明らかとなってきている。そこで次に、癌細胞が骨芽細胞に作用し破骨細胞形成因子を産生させている可能性について検討を行った。その結果、A375M細胞,MDA-MB-231細胞およびH-31細胞の培養上清はいずれも骨芽細胞様細胞Saos-2細胞からのIL-11産生を顕著に増加させた。Saos-2細胞単独の培養上清は、骨吸収活性測定系においてCa遊離作用を示さなかったが、A375M細胞培養上清で処理したSaos-2細胞の培養上清は、A375M細胞培養上清と比較しても有為な骨吸収活性を示し、その活性は抗IL-11抗体によって阻害された。

　これらの結果より、溶骨性癌細胞の示す溶骨反応は、癌細胞が骨芽細胞からのIL-11産生を誘導し、そのIL-11が破骨細胞の形成を促進することにより引き起こされる経路が存在する可能性が示唆された。

　癌細胞由来の液性因子が骨芽細胞のIL-11産生を誘導すると考え、IL-11産生誘導因子の癌細胞における発現について、RT-PCR法を用い検討した。その結果、IL-1 mRNAは、A375M細胞およびMDA-MB-231細胞で、TGF-₁,M-CSFおよびPTHrPのmRNAはいずれの癌細胞においても発現が認められた。

　そこで、これらサイトカイン/ホルモンの中和抗体/アンタゴニストを用い、A375M細胞培養上清によるSaos-2細胞からのIL-11産生促進の阻害活性について検討したところ、抗TGF-中和抗体のみが阻害作用を示した。また、MDA-MB-231細胞,H-31細胞培養上清によるIL-11産生促進作用も抗TGF-中和抗体にて阻害された。

　これらのことから、これら癌細胞の産生するTGF-₁が骨芽細胞のIL-11産生を促進している可能性が示唆されたため、A375M細胞培養上清のTGF-活性を、Mv1Lu細胞のDNA合成阻害活性を指標として測定した。しかしながら、A375M細胞培養上清中には活性型及び潜在型TGF-活性は認められず、むしろSaos-2細胞が潜在型TGF-を産生していることが明らかとなった。また、Saos-2細胞をA375M細胞培養上清で処理した培養液中に活性型TGF-が出現した。このことより、Saos-2細胞からのIL-11産生を促進するTGF-はA375M細胞由来ではなく、Saos-2細胞が産生した潜在型TGF-をA375M細胞培養上清が活性化したものであると考えられた。