TGF-スーパーファミリーに属するアクチビンの受容体であるアクチビン受容体II型(ActR-II)と同じく細胞内にセリン/スレオニンキナーゼドメインを持つ1回膜貫通型の受容体構造を有するC.elegansのdaf-1遺伝子産物で保存された配列EXVAVK、HRDIKSに対するオリゴヌクレオチドをプライマーとしたRT-PCRから出発し、Low Stringency Hybridizationを繰り返すことにより、5種のセリン/スレオニンキナーゼ型受容体遺伝子をクローニングした。この中で、BMP応答細胞株CFK1細胞からクローニングしたCFK-23a、CFK-43aが単独で、特異的にBMPに結合した。

　CFK-43a、CFK-23aはそれぞれ、502アミノ酸および532アミノ酸からなる。セリン/スレオニンキナーゼ型受容体蛋白ファミリーの中で、細胞内のキナーゼドメインにおいては、CFK-43aとCFK-23aはお互いに最も高い相同性を示し、85%のアミノ酸が一致している。他のI型受容体とは平均で65%、II型受容体とは38%である。この相同性と、キナーゼドメインの直上流およびキナーゼドメイン内にI型受容体に特徴的な配列があること、また、キナーゼドメインの下流の長さが短いという特徴から、CFK-43a、CFK-23aはI型受容体に分類される。

　細胞外のCys残基に富むリガンド結合領域においても、CFK-43aとCFK-23aは最も高い相同性を示すが、細胞内よりは低く、59%である。この領域において、CFK-43aとCFK-23aは、II型BMP受容体であるBMPR-II、daf-4を含めた他のI型、II型受容体とCys残基の配置の保存性を示すが、アミノ酸レベルでの相同性は12-28%と低い。

　CFK-43a、CFK-23aは単独で、BMP-4に結合し、結合定数(Kd)はそれぞれ0.53nM、1.3nMであった。CFK-43aの結合親和性は、BMP-4,-2>BMP-2/6>BMP-3,-5,-6,-7の順で、TGF-には結合親和性を示さなかった。CFK-23aの結合親和性はBMP-4,-2>BMP-2/6>BMP-3,-5,-6,-7,TGF-の順で、TGF-にも弱い結合親和性を示した。すなわち、CFK-23aに比べて、CFK-43aがより特異的かつ強くBMPに結合することが示された。

　in situハイブリダイゼーションによる解析で、発生過程の四肢において、CFK-43a mRNAは前軟骨性間充織(骨形成部位)に特異的かつ一過性に強く発現しており、BMP-2と相補的な発現様式であることが示された。一方、新生児マウスの骨では、CFK-43a mRNAの発現は極めて弱かった。すなわち、CFK-43a mRNAの発現は、骨格形成時に一過性に強く発現誘導されるように、厳格に制御されていることが示唆された。CFK-23a mRNAは、CFK-43a mRNAとは対照的に、脾臓を除く広い組織分布を示し、BMP応答細胞のみならずBMP非応答性のマウス繊維芽細胞NIH3T3細胞でも検出された。

　BMP-2からBMP-8の中で保存されている配列W-Q/N-D-W-I-V/I-AおよびH-A-I-V/L-Q-T-Lに対するオリゴヌクレオチドをプライマー、ヒト染色体DNAを鋳型としたPCRを行い、BMP類縁遺伝子の配列を得た。このBMP類縁遺伝子配列由来の38merのオリゴヌクレオチドをプローブとして、ヒト染色体遺伝子ライブラリーをスクリーニングし、BMP類縁蛋白ヒトhBMP-12(hBMP-12)の成熟蛋白部分を含む遺伝子をクローニングした。さらに、hBMP-12遺伝子の部分断片をプローブとして、ヒト染色体遺伝子ライブラリーをスクリーニングし、BMP類縁蛋白ヒトBMP-13(hBMP-13)の成熟蛋白部分を含む遺伝子をクローニングした。hBMP-12、hBMP-13は、成熟蛋白部内ではそれぞれ、97%、99%のアミノ酸が保存されていることから、先に報告されたマウスGDF-7、GDF-6のヒトカウンターパートと考えれる。hBMP-12、hBMP-13、既報のヒトGDF-5(hGDF-5)は、保存された1番目のCys残基からC末までの領域で互いに81%-86%のアミノ酸配列が一致しており、TGF-スーパーファミリーに属するBMP/GDFファミリーの中に独立したサブファミリーを形成している。

　大腸菌で発現・調製したhBMP-12を、他のBMPの場合と同じく担体とともにラットの皮下もしくは筋肉中に埋植することにより、その組織形成誘導活性を組織学的、分子生物学的に解析した。その結果、hBMP-12に腱/靭帯組織を形成誘導する活性があることが明らかとなった。hBMP-13、hGDF-5にも同様の活性が認められた(下表)。同じ部位への埋植でhBMP-2は骨/軟骨組織を形成誘導することから、BMP-12、BMP-13、GDF-5は、おそらくBMP-2受容体とは異なる受容体を介して腱/靭帯組織を形成誘導することが示唆された。

表 BMP-12、BMP-13、GDF-5およびBMP-2の組織形成誘導活性ラットの皮下にhBMP-12、hBMP-13、hGDF-5を25g、hBMP-2を5g埋植し、10日後に形成された組織の解析結果

　発生過程において、腱・靭帯が形成される部位である関節近辺での発現をin situハイブリダイゼーションで検討した結果、同じく異所性に腱・軟骨を形成誘導するBMP-13、GDF-5が滑膜関節の骨と骨の接触面(関節軟骨)に発現しているのに対して、BMP-12は肩甲骨の腱・靭帯の形成、付着部および指の先端の腱の付着部に隣接した部分で発現していることが示された。BMP-12が実際に腱・靭帯の器官形成に重要な役割を果たしていることを示唆される。

　非標識BMP-12で、¹²⁵I-BMP-4の受容体への結合阻害について検討した結果、BMP-12はBMP-2、BMP-4に比べて弱いながら、CFK-43a、CFK-23aに低親和性で結合することが示めされた。骨系への分化の指標であるアルカリフォスファターゼ(ALP)の産生誘導に関して、BMP-2応答するマウス筋芽細胞C2C12株(CFK-23a発現、CFK-43a非発現)はBMP-12に応答しなかったが、RobC26細胞(CFK-23a発現、CFK-43a発現)はBMP-12の濃度依存的にALPを産生した。このことは、BMP-12がCFK-43aを介してALP産生を誘導しうる可能性を示唆する。この可能性は、C2C12株にCFK-43aを発現させた形質転換細胞株にBMP-12を作用させた結果、親株および発現ベクターのみの導入株ではみられないBMP-12の濃度依存的なALP産生誘導がみられたことにより証明された。BMP-12、CFK-43aの発現はともに限局されていることから、BMP-12の骨形成シグナルが伝達される部位は、両者の発現が隣接している腱/靭帯の付着部の骨表面に限局されると考えられる。