我が国では1960年代前半に深刻な公害問題が起き、PCBによるカネミ油症事件や、有機水銀による水俣病などは未だ多くの人の記憶に新しいところである。それらを教訓として、化学物質の安全性を事前に審査し規制することを目的とした「化学物質の審査及び製造等の規制に関する法律(化審法)」が制定された。化審法によって規定された分解度試験では、活性汚泥を用いて同一条件下で化学物質の分解度を測定している。この活性汚泥の分解活性の力価を測定するための指標物質としてanilineが用いられている。しかし、分解度試験条件下において活性汚泥中のどのような細菌がaniline分解に関与しているのか、活性汚泥の培養期間が長くなるとラグライムはなぜ長くなるのかなど未解明な部分が多く残っていた。特に、ラグタイムが7日以上になると分解度試験が成立しないことから、試験の実施に際して重要な問題となっている。そこで、まず活性汚泥中のaniline分解菌数の測定方法を確立し、これを用いて培養時にラグタイムが長くなる原因を明らかにすることとした。さらに、活性汚泥からaniline分解菌を単離し、細菌学的同定、および活性汚泥への添加効果を調べることも試みた。 一方、anilineと同様に含窒素芳香族化合物であり、工業原料として多く利用され、難分解性の環境汚染物質としても知られているcarbazoleの微生物分解に関する研究を行った。本研究を開始した時点では、carbazoleを資化する細菌、および分解経路についての報告はなかった。このため先ず分解菌の単離を試み、次いで分解菌の分布、分解代謝経路の解明、さらに分解系酵素遺伝子の単離および解析を実施した。 1.分解度試験におけるanilineの分解 -活性汚泥中のaniline分解菌数の計測と分解菌の単離- Aniline分解菌に関しては、多数報告されているが、分解度試験に用いられる活性汚泥中のaniline分解菌に関する研究報告はほとんどない。本論文では、活性汚泥中のaniline分解菌数の計測にMPN法を適用し、aniline分解菌数が培養4週目から6週目にかけて急激に減少することを明らかにした。 また、活性汚泥からaniline分解菌、Pimelobacter simplex N1株およびArthrobacter sp.Y5株を単離した。両菌株によるaniline分解代謝経路を明らかにするために、GC-MSを用いて分解代謝物の同定を行った。その結果、anilineは脱アミノ反応によりcatecholに変換され、続いてcatecholのortho開裂によりcis,cis-muconic acidに分解されることが判明した。一方、活性汚泥にN1株あるいはY5株を添加することにより、aniline分解のラグタイム(通常3〜5日)が、約1.5日と短縮されたことから、単離菌株の活性汚泥への添加が顕著な分解促進をもたらすことも示された。 2.Carbazole分解菌の単離と分解代謝経路の解明 202種類の農耕地土壌と4種類の下水処理場活性汚泥からcarbazole分解菌をスクリーニングし、千葉県内の農耕地土壌からPseudomonas sp.CA06株を、東京都内の活性汚泥からPseudomonas sp.CA10株を単離した。両菌株はcarbazoleを炭素源および窒素源として利用することが判明した。また、carbazole分解菌は、活性汚泥から高頻度で見出されたことにより、農耕地土壌よりも活性汚泥における存在確率が高いと考えられる。 Carbazoleは水に難溶であることから分解効率を高めるために溶媒によるcarbazoleの分散効果を検討した。分散助剤として終濃度3%のジメチルスルホキシドを用いてcarbazoleをcarbon-freeの培地に溶解し、それにCA06株あるいはCA10株を接種・培養することで、17mMのcarbazoleが210時間で95%以上分解されることが確認された。また、同時に著量の分解代謝物の生成も認められた。GC-MS分析によって、分解代謝物は、anthranilic acidおよびcatecholと同定された。さらに微量の代謝物として、2’-aminobiphenyl-2,3-diolと、そのmeta開裂化合物である2-hydroxy-6-oxo-6-(2’-aminophenyl)hexa-2,4-dienoic acidも同定された。また、carbazoleの代謝中間体のanthranilic acidを生育基質として培養した場合、代謝物としてcatecholとcis,cis-muconic acidが同定された。以上の結果から図に示すcarbazoleの分解代謝経路が明らかになった。  Proposed pathway of carbazole degradation in strains CA06 and CA10.(1),carbazole;(2),2’-aminobiphenyl-2,3-diol;(3),2-hydroxy-6-oxo-6-(2’-aminophenyl)hexa-2,4-dienoic acid;(4),anthranilic acid;(5),catechol;(6), cis,cis-muconic acid;(7),2-hydroxypenta-2,4-dienoic acid;(8),2,6-dioxo-6-(2’-aminophenyl)hexa-4-enoic acid;(9),6-oxo-6-(2’-aminophenyl)hexa-4-enoic acid;(10),5-oxo-5-(2’-aminophenyl)penta-3-enoic acid;(11),2-hydroxy-6-oxo-6-(2’-aminophenyl)hexanoic acid.3.Carbazole分解系酵素遺伝子の単離と解析 新たに福岡県および佐賀県の下水処理場の返送汚泥からcarbazole分解菌をスクリーニングし、Pseudomonas stutzeri OM1株を単離した。Carbazoleからの代謝物を調べた結果、OM1株は、先に取得されたCA06株やCA10株と同様に、carbazoleをanthranilic acidに変換する代謝経路を有していた。しかし、catecholの分解代謝はCA06株およびCA10株と異なり、meta開裂経路によることが判明した。 次に、OM1株を用いてcarbazoleのクリアーゾーンを指標としてcarbazole分解系酵素遺伝子のクローニングを試みた。その結果、carbazoleからanthranilic acidまでの変換に関与する6.9-kb EcoRI遺伝子断片が得られ、これの塩基配列の決定と解析を行った。6.9-kb EcoRI遺伝子断片には8個のORFが認められ、データベース検索を実施したところCA10株のcarbazole分解系酵素遺伝子と、全長にわたって高い相同性を示すことが判明した。また、ORF1とORF2は全く同じ塩基配列であり、Rieske-typeの[2Fe-2S]クラスターとの結合に関与すると考えられるアミノ酸配列(CXHX16-17CXXH)があり、さらに酸素活性化部位と予想される配列(GX3-4DX2HX4-5H)も見い出された。以上の結果から、ORF1およびORF2はcarbazole dioxygenase(CARDO)のterminal oxygenase componentと推定され、これをCA10株の分解系酵素遺伝子と同様にcarAaと名付けた。ORF3は、サブクローニング実験の結果からmeta開裂酵素をコードすることが予想され、ORF4から推定されるアミノ酸配列は、protocatechuate 4,5-dioxygenase familyのLigBと31.3%の相同性を示した。CA10株の分解系酵素遺伝子との比較から、ORF3とORF4は、ともにmeta開裂酵素活性に関与すると判断され、それぞれcarBaとcarBbと名付けた。 同様に、ORF5、ORF6、およびORF8は、それぞれmeta開裂化合物加水分解酵素、ferredoxin、ferredoxin reductase componentをコードすると推定されたことから、CA10株と同様に、それぞれcarC、carAcおよびcarAdと名付けた。ORF7に関しては、DNAおよび推定アミノ酸配列のデータベース検索を実施したが、類似の配列は確認されず、現在のところ、その機能は明らかではない。 Catecholのmeta開裂により生ずる黄色物質を指標にショットガンクローニングによって得られたcatecholのmeta開裂酵素遺伝子を含むpSP101には3個のORFの存在と4番目に位置するORFの5’-末端の存在が確認された。データベースの相同性検索結果からORF1がchloroplast-type ferredoxinを、ORF2はcatechol 2,3-dioxygenase(C23O)を、ORF3が2-hydroxymuconic semialdehyde dehydrogenase(HMSD)を、ORF4が2-hydroxymuconic semialdehyde hydrolase(HMSH)をコードすることが判明した。ORF2およびORF3から推定されるアミノ酸は、xyleneやtolueneの分解に関与するTOL plasmid pWW0の分解系酵素と約90%の相同性を示したことから、これらとの関連が強く示唆された。 芳香族化合物の異化様式はcatabolic funnelと形容されるように、初発酸化反応は多くの化合物にとって多様性に富むが、catecholから下流の代謝経路は共通になると考えられている。Carbazoleの代謝経路においても、初発酸化反応の様式はきわめて特異なものであったが、catecholよりも下流の分解系酵素については、その他の芳香族化合物の分解系酵素と類似性の高いものであることが遺伝子配列より確認された。さらに、地理的に1000km以上離れた地区の下水処理場の活性汚泥から単離されたCA10株とOM1株が、同様のcarbazole分解代謝経路および分解系酵素遺伝子を保有していたことは、活性汚泥に存在する細菌間での分解系酵素遺伝子の水平伝播の可能性を示すものであり、遺伝子の水平伝播のメカニズムを解明する一つの手がかりが得られたものと思われる。 |