テルペン類は香料の原料として有用であるが、光学活性を有するものが多いので合成が困難な物が多い。本研究では温泉、土壌等よりテルペン類の不斉合成に有用な好熱性微生物を分離しバイオリアクターへの応用を検討した。タバコの香料成分であるDihydro-4-oxoisophorone(DOIP)(2)を基質としてスクリーニングを行った結果、DOIPを不斉還元する好熱性微生物NS-13株を土壌より分離した。NS-13はBacillus stearothermophilusと同定され、この株は53℃を至適温度とする中度好熱性細菌であった。4-oxoisophorone(OIP)(1)を不斉還元する好熱性微生物については、Thermomonospora curvata IFO-12384が報告されていたが、DOIPを不斉還元する微生物の報告は無かった。NS-13はDOIPを不斉還元し4-hydroxy-2,2,6-trimethylcyclohexanone(4-HTMCH)(3)を生成した。また、(1)細胞の比増殖速度と反応物の生成速度の関係、(2)DNA gyrase阻害剤であるNovobiocinを添加した実験より、この変換は増殖連動型であることを明らかにした。

　Bacillus stearothermophilus NS-13によるDOIPから4-HTMCHへの変換は増殖連動型であることから、バイオリアクターにおいて高い生産性を達成するには微生物の増殖を常に促進しかつ細胞濃度を維持することが必要である。そこで従来より知られている、エアーリフト型リアクター及び撹拌槽型リアクター(CSTR)と新たなホローファイバー型リアクターを用いて検討した。その結果、エアーリフト型、CSTRでは、希釈率を上昇させると細胞のwash-outが起きて細胞濃度が減少し、結果的に生産性の低下を招いた。ホローファイバー型では、細胞を膜で濾過してリアクター内に保持し、細胞濃度を高めることに成功し、変換率も向上した。しかし一定時間(48h)後、細胞濃度が高いにもかかわらず変換率が低下した。この原因は細胞の増殖が阻害された事にあると考え、リアクターのシェル(胴)側から細胞の一部を抜き取る事で増殖を刺激し解決した。ホローファイバー型リアクターの条件検討から、シェル(胴)側からの抜き取り率を培地供給量の10%に保つ事で、最大の細胞濃度と細胞増殖が維持され、高い希釈率においても長時間安定した高い生産性を達成することができた。

　OIPがThermomonospora curvata IFO-12384によりDOIPに不斉還元される事は既に報告されている。本研究ではT.curvataとB.stearothermophilus NS-13を組み合わせることにより、OIPからDOIPを経由して4-HTMCHへの二段変換について検討した。従来二段変換の組み合わせとして、1段目の培養液から細胞を除去する方法、細胞を化学的に処理して失活させる方法が知られているが、コスト面、雑菌汚染の面から工業的な方法としては不適当である。本研究では、1段目の培養液に特別な操作を行わず2段目の培養を行う事を目指して検討した。

　T.curvataとB.stearothermophilusの混合培養系ではB.stearothermophilusが支配的に増殖し二段変換は進行しなかった。1段目をT.curvata単独で培養しその培養液にB.stearothermophilusを植菌し2段目培養した結果、二段変換が達成された。条件検討の結果、1段目培養終了液のpHを中性に修正し、かつT.curvata細胞が存在した方が2段目培養においてB.stearothermophilusの生育が良いことが判った。B.stearothermophilusは新たに栄養源を追加しなくても生育した。B.stearothermophilusは、T.curvata細胞の分解物を栄養源として利用したものと思われる。以上の如く、特別な操作を行うこと無く二段変換を行う条件を確立した。

　単一の微生物変換を行ったバイオリアクターの報告は数多くあるが、二段以上の微生物変換を複数の微生物を用いて行ったバイオリアクターの報告はほとんど無い。本研究では二種類の好熱性微生物を用いて、OIPからDOIPを経由し4-HTMCHへ至る連続二段変換を可能にするバイオリアクターの検討を行った。バッチ二段変換の結果をもとに、1段目ではT.curvata IFO-12384によりOIPからDOIPへ変換し、2段目ではB.stearothermophilus NS-13によりDOIPから4-HTMCHへ変換させる事とした。菌体の固定化にはPAA(polyacrylamide)を使用し、バイオリアクターとしては、(1)エアーリフト型(T.curvata free cell)+エアーリフト型(B.stearothermophilus free cell),(2)エアーリフト型(T.curvata PAA immobilized cell)+エアーリフト型(B.stearothermophilus PAA immobilized cell),(3)撹拌槽型(CSTR)(T.curvata PAA immobilized cell)+ホローファイバー型(B.stearothermophilus free cell)の三種類を用いた。その結果(3)において最も安定した連続二段変換が見られ、かつ高い生産性が達成された。

　本研究は、好熱性微生物菌体を生体触媒として、選択的化学反応を目的とするバイオリアクターに応用出来る事を示した。特に50℃と言う操作温度は、雑菌汚染を防止できかつ温度制御が容易であることから、リアクター構造を単純化し運転コストを低減出来るという工業的利点を持つ。また、従来の微生物変換は主に定常期にある細胞内の酵素を利用したものが多いが、本研究は増殖期の細胞でのみ活性化する酵素を利用できることを示しており、工業的に利用可能な酵素の範囲を拡大した。このような好熱性微生物を用いたバイオリアクターは、光学活性を示す化合物の工業的合成法として今後採用される例が増えて行くものと考えられる。

　1.Kunio Nishii,Koji Sode,Isao Karube;Journal of Biotechnology,(1989),117-128

　2.Kunio Nishii,Koji Sode,Isao Karube;Biotechnology and Bioengineering,(1990),1155-1160

　3.Kunio Nishii,Koji Sode,Isao Karube;Applied Microbiology and Biotechnology,(1990),245-250

　4.Kunio Nishii,Koji Sode,Isao Karube;Biotechnology Letters,(1995),785-790