レトロウイルスは、Gag前駆体蛋白とGag-Pol融合蛋白とをゲノムサイズのRNAから、約10対1の割合で翻訳している。マウス白血病ウイルスにおいては、この調節は、gag遺伝子の終止コドンUAGが、10回に1回の割合でグルタミンと読まれることで実現される。この終止コドンUAGをCAG(グルタミンコドン)に点変異し、100%がGag-Pol融合蛋白として読まれるようにしたウイルスMLV-B(CAG)からは、感染性粒子産生が全くなくなる。このMLV-B(CAG)プロウイルスをトランスフェクトした細胞を長期培養すると、変異ウイルスが出来、増殖を開始するようになった。このようなウイルスを解析すると、pol遺伝子の大部分を欠失してgagとenvの2つの遺伝子を発現する欠損型ウイルスGE6.4が、MLV-B(CAG)を相補して、感染性粒子の産生を可能にしていることが明らかになった。MLV-B(CAG)が発現するGag-Pol融合蛋白だけではGag蛋白のプロセシングは殆ど起きないが、GE6.4が発現するGag前駆体蛋白がtransに存在することで、Gag-Pol融合蛋白上のプロテアーゼが十分に活性化されることが分かった。

　第1部の実験で、GagとEnvをコードするGE6.4が、Gag-PolとEnvをコードするMLV-B(CAG)を相補することが分かったが、MLV-B(CAG)はEnvをすでにコードしているので、GE6.4がコードするEnv蛋白は、相補に不要な可能性がある。この点を明らかにするため、まず、Gag前駆体蛋白だけを発現するウイルスによるMLV-B(CAG)の相補を試みた。GE6.4のenv遺伝子部分に5塩基を挿入して、Env蛋白の読み取りを不能としたウイルスGEBstEは、Gag前駆体蛋白だけをGE6.4と同レベルで発現し、Gag蛋白のプロセシングで見る限り、MLV-B(CAG)をGE6.4と同じように相補した。が、相補ウイルスの定量曲線を調べてみると、このウイルスの感染・増殖は、GE6.4との相補ウイルスに大きく及ばないことが分かった。おそらく、GE6.4のEnv蛋白が相補ウイルスの感染に重要な役割を果たしていることが示唆された。しかし、このタイプの実験では、明確な結論を得られないので、GE6.4のenv遺伝子部分を、宿主域の異なるamphotropicやxenotropicのenv遺伝子と組み換えたウイルスGE-amやGE-xeを作成し、それらによるMLV-B(CAG)の相補を行った。その結果、GE6.4タイプのウイルス(GE-amやGE-xe)がコードするEnv蛋白が、相補ウイルスの宿主域を主として決定することが分かった。従って、MLV-B(CAG)の発現するEnv蛋白だけでは、感染性のウイルス産生には十分でないことが結論された。

　しかし、MLV-B(CAG)は、env遺伝子発現に関わる塩基配列に変異はなく、RNAの発現パターンに野生型との差異は認められなかった。従って、MLV-B(CAG)から発現するEnv蛋白が何故、感染性粒子形成に不十分であるのか、その原因を調べた。野生型の感染増殖している細胞では、野生型のプロウイルスコピー数は、MLV-B(CAG)を発現している細胞が1であるのに対し、平均8コピー程度に増えていた。細胞当たりのRNA発現量も、それに応じ、野生型感染細胞はMLV-B(CAG)発現細胞の8倍であった。同時に、細胞当たりのEnv蛋白の発現量を比較したところ、蛋白レベルでは8倍を上回る差異が認められた。MLV-B(CAG)のプロウイルスコピー数が少なく、そのため、MLV-B(CAG)から発現するEnv蛋白量が機能蛋白の生成に不十分であることが、MLV-B(CAG)の発現するEnv蛋白だけでは、感染性のウイルス産生に十分でない理由であると考えられた。

　MLV-B(CAG)から発現するEnv蛋白が感染性粒子形成に不十分であるのは、細胞当たりのプロウイルスコピー数が少ないことが原因であると考えられたので、細胞内のプロウイルスコピー数を増やすことで、十分なウイルス産生が可能となるかどうかを検討した。野生型のウイルスは再感染を起こしてコピー数が増加してしまう。一方、点変異のMLV-B(CAG)では野生型への復帰変異が生じやすいので、この実験には、pol遺伝子内に306塩基の小欠失を持つ非感染性のwtを用いた。wtのRNAの発現量・パターンは、1コピー当たりで比較すれば、MLV-B(CAG)や野生型ウイルスの平均値と同じであった。wtをNIH3T3細胞に繰り返し導入し、最大8ケまでの種々のプロウイルスコピー数を有する細胞クローンを得た。これらの細胞クローン間で、RNA発現量・Env蛋白発現量・MSV感染に対する干渉の程度・XC細胞融合の誘導能・培養上清へのウイルス粒子の産生量について比較検討した。その結果、RNA発現量はプロウイルスコピー数に比例して増加するが、Env蛋白発現量やEnv蛋白の機能に基づく干渉ならびにXC細胞融合能、そしてウイルス粒子の産生量は、プロウイルスコピー数が3から4を境として大きく上昇することが分かった。この実験により、機能的なEnv蛋白の生成とウイルスの効率良い産生が起きるには、細胞内のRNA発現量に閾値が存在することが結論された。本実験は、プロウイルス当たりのRNA発現量が一定となる系を用いていたため、野生型の感染時にも同様のプロウイルス数とRNA発現との相関があるかどうかは不明であるが、野生型のウイルスがNIH3T3細胞に感染増殖する際には、細胞内のプロウイルスコピー数が平均8から10コピー迄増えていることから、プロウイルスコピー数の増加がRNA発現量を増加させる重要な因子の一つとなっていることが想定される。その上限は、細胞の干渉現象によって制限され、細胞が破壊されるような過剰量のウイルス蛋白発現には至らないようになっていると考えられる。干渉現象の生物学的意味は、今まで注目されて来なかったが、細胞傷害を起こさないウイルスにおいて、細胞当たりの適切なウイルス蛋白発現量を制御する機能を果たしている可能性が考えられた。

　以上、本研究はマウス白血病ウイルスのgag遺伝子終止コドンのreadthro ugh変異の解析で開始されたが、感染性粒子形成に必要な構造蛋白発現量の検討から、機能的なウイルス構造蛋白の十分な生成には、細胞内のウイルスRNA量が一定の閾値を越える必要のあることが分かった。ウイルスRNA量を閾値以下にコントロールすることで、ウイルス複製を抑え得る可能性が示唆された。