好酸球におけるPAF受容体の構造と性質、及び好酸球の分化と受容体の発現との関係を明らかにするために、好酸球性白血病細胞株であるEoL-1細胞をモデルとして種々の検討を行った。EoL-1細胞は分化誘導剤であるsodium n-butyrateで処理すると、より成熟した好酸球様の表現型を示すことが知られている。まず、EoL-1細胞をsodium n-butyrateの存在下で培養した後、PAFに対する細胞内カルシウム応答を調べたところ、培養3日目まで反応性が増大し、以後プラトーとなった。この経時変化は分化のマーカーとして用いたロイコトリエンC₄合成酵素活性の増加とよく一致していた。また、PAF受容体結合実験を行ったところ、受容体の親和性には変化がなくBmaxが増大していたことから、EoL-1細胞の分化に伴ってPAF受容体発現量が増加した結果、PAFに対する応答性が増大することが示唆された。PAF受容体cDNAは1991年にモルモット肺から初めて単離され、推定されるタンパクはGTP結合蛋白質に連関する受容体のファミリーに属することが明かとなっている。しかしながら好酸球に発現しているPAF受容体の構造については不明であった。そこで、分化させたEoL-1細胞cDNAライブラリーを作製し、好酸球のPAF受容体cDNAクローニングを試みた。モルモットPAF受容体cDNAをプローブとして常法に従いスクリーニングを行ったところ、6つのクローンが得られた。これらのクローンはすべて同一の遺伝子に由来し、その翻訳領域はすでにヒトの他の臓器から単離されているcDNAのものと一致していた。分化させたEoL-1細胞について、得られたcDNAクローンをプローブとしてNorthern blot解析を行なったところ、受容体結合実験の結果と同様の経時変化でPAF受容体mRNAが誘導されることが明らかとなった。さらに、PAF受容体cDNAの塩基配列をもとに合成したペプチドに対するモノクローナル抗体を作製し、FACScan解析を行い、分化させたEoL-1細胞ではやはりPAF受容体数が増加していることを確認した。以上の結果より、EoL-1細胞の分化に伴い、PAF受容体発現量が転写レベルで誘導され、PAFに対する応答性が増大することが明らかとなった。アレルギー炎症性疾患の病巣局所へ集積した好酸球は分化の最終段階にあることが形態学的に認められることから、この様な好酸球ではPAF受容体発現量が増加しており、そのためPAFに対する応答性が増大している可能性が考えられた。

　PAFに対する応答に関与するGTP結合蛋白質のタイプは、細胞の種類によって異なることが知られている。分化させたEoL-1細胞のPAFによって惹起される細胞内カルシウム応答及びIP₃の産生は、百日咳毒素によって部分的に阻害されたことから、EoL-1細胞では細胞内カルシウム応答に関与するGTP結合蛋白質は、百日咳毒素感受性のものと非感受性のものの少なくとも2種類が存在することが示唆された。

　最近、IL-5、IL-3、GM-CSF等の好酸球の分化に関わるサイトカインの刺激により、健常人末梢血好酸球のPAFに対する遊走能などの応答性が増大することが報告されている。そこで、健常人末梢血好酸球のPAF受容体の発現におけるこれらのサイトカインの影響について検討した。IL-5の存在下12時間培養した健常人末梢血好酸球についてPAF受容体結合実験を行なったところ、無処理の細胞に比べPAF受容体数が約2倍にまで増加することが明らかとなった。このIL-5処理による受容体数の増加は培養6時間後から認められ、12〜18時間後でプラトーに達していた。同様にIL-3又はGM-CSFについても調べたところ、IL-5と同程度の受容体数の増加が認められた。また、IL-5処理により好酸球のPAFに対する細胞内カルシウム応答は増大したことから、受容体発現量の増加を介して好酸球のPAFに対する応答性が亢進することが示唆された。次に、この受容体数の増加がどの段階で制御されているのかについて明らかにするために、RT-PCRを用いたPAF受容体mRNA量の比較定量の系を確立し、PAF受容体mRNA発現量に対するIL-5の影響について検討した。その結果、受容体結合実験の結果と同様、PAF受容体mRNA量も約2倍にまで増加していることが明らかとなった。さらに、IL-5処理によりPAF受容体mRNAの安定性には影響がなかったことから、IL-5によるPAF受容体数の増加は転写の促進を介して起こることが示唆された。

　PAF受容体mRNAには、翻訳領域は共通であるが5’上流非翻訳領域が異なるTranscript1及びTranscript2の少なくとも2種類が存在することが知られている。各mRNAに特異的なprimerを用いてRT-PCRを行った結果、好酸球ではTranscript1のみが発現しており、IL-5によってTranscript1の転写が促進されることが示唆された。Transcript1のプロモーター領域には、現在までに報告されているIL-5responsive elementに相当する配列は存在しておらず、まだ明らかにされていないelementが存在する可能性が考えられた。

　実際にアレルギー炎症性疾患においてPAF受容体の発現の変化が起きているのか否かを明らかにするため、健常人(8例)及び、アトピー性気管支喘息患者(5例)の末梢血好酸球におけるPAF受容体発現量を比較した。その結果、患者好酸球では健常人好酸球に比べPAF受容体数が有意に増加していることが明らかとなった。そのレベルは健常人好酸球をIL-5で処理した際の値に近いものであった。また、PAF受容体mRNAも同様に増加していた。患者好酸球をIL-5で処理したところ、健常人好酸球とは異なり、さらなるPAF受容体数の増加は認められなかった。一方、IL-3、GM-CSFの場合、患者好酸球においてもPAF受容体数の増加は見られたことから、患者の好酸球はすでにIL-5の刺激を受けている可能性が示唆された。

　以上の結果より、アトピー性気管支喘息患者において、循環血中で好酸球がIL-5の刺激を受けた結果、転写レベルでPAF受容体発現量が増加し、好酸球のPAFに対する応答性が亢進することが強く示唆された。IL-5は好酸球に特異的に作用するサイトカインであることから、このPAF受容体の増加がアレルギー炎症性疾患における好酸球の選択的な浸潤、活性化の機構の一部を説明するものであると考えられる。

　ヒト好酸球性白血病細胞株であるEoL-1細胞を分化誘導剤処理した後cDNAライブラリーを作製、PAF受容体cDNAクローニングを試みた。その結果肺組織から得られたcDNAと同じであった。推定される部分ペプチド配列に対する抗体を作製しタンパク質レベルでも発現を追求できるプローブの作製に成功した。さらに受容体と連関するGタンパク質としてEoL細胞において(おそらくは好酸球においても)百日ぜき毒素感受性と非感受性の2種あることもあきらかにした。

　EoL-1細胞を分化誘導剤で処理すると、PAFに対する応答性が亢進し、Northern blot解析より応答性亢進と同じ時間経過でPAF受容体mRNAが誘導されていることが判明した。アレルギー炎症性疾患の病巣局所へ集積した好酸球は分化の最終段階にあることが形態的に認められており、「好酸球が分化、PAF受容体が誘導され、PAFへの応答性が亢進し炎症局所に集積する」と推定された。

　様々のサイトカインのうち、IL-5、IL-3、GM-CSFの存在下12時間培養するとPAF受容体がタンパク質レベル、mRNAレベルで2倍以上増加することを発見した。これらのサイトカインが刺激となって好酸球が分化、成熟し、炎症局所に蓄積すると推定された。

　アトピー性気管支喘息患者の末梢血好酸球におけるPAF受容体量は健常人と比較して明らかに増加していた。mRNAレベルでの上昇も認められた。患者好酸球をIL-5で処理してもPAF受容体のさらなる増加は認められなかった。一方、IL-3やGM-CSFでは好酸球上の受容体数の増加が起こることより、患者の好酸球はすでにIL-5の刺激を受けている可能性が高い。

　以上、本研究はアトピー性気管支喘息などの成因にIL-5と好酸球、好酸球上のPAF受容体発現亢進、感受性増大が関わっている可能性を主として分子生物学的手法で示したもので、生命薬学、免疫化学、アレルギー学の発展に寄与するところがあり、博士(薬学)の学位に値すると判定した。