CA10株のゲノムライブラリーからメタ開裂活性を指標として、CAR代謝に関与する酵素遺伝子を含む6.9-kb EcoRI断片を取得した。このDNA断片を含むプラスミドpUCA1を保持する大腸菌がCARからANへの変換能を有していたことから、このDNA断片上にCARのANへの変換に関与する酵素がコードされていることが示された。

　取得された遺伝子断片の塩基配列を決定したところ、8個のopen reading frames(ORFs)の存在が示された。相同性検索と機能解析の結果から、ORF1(carBa)、ORF2(carBb)にコードされる2つのタンパク質がメタ開裂活性の発現に必須であり、classIIIに分類されるユニークなメタ開裂酵素であることが示された。また、ORF3は加水分解酵素(CarC)をコードしており、基質特異性を調べた結果、CarCはCAR分解系の代謝中間体である2’-aminobiphenyl-2,3-diolのアナログである2,3-dihydroxybiphenylのメタ開裂物質(HOPDA)に対しては強い活性を示したが、単環式芳香族化合物であるtoluene分解系の中間代謝物である3-methylcatecholのメタ開裂物質(HOHDA)には非常に低い活性しか示さなかった。CarCの推定アミノ酸配列は、既知のHOPDA hydrolaseよりはむしろHOHDA hydrolaseと相同性が高く、基質特異性と相反する結果となった。一方、ORF4とORF5は全く同じ塩基配列であったが、既知のdioxygenaseで保存されている領域が存在したことと、休止菌体反応による活性測定の結果から、CARDOのterminal oxygenase(CarAa)をコードしていることが明らかになった。また、ORF6、ORF8がそれぞれferredoxin(CarAC)、ferredoxin reductase(CarAd)をコードしていることも明らかになり、CARDOは3つのcomponentsから構成されることが示された。ORF7はCARDO活性の発現に必要でないことも示された。この様な結果から、car遺伝子群は、carAaAaBaBbCAc(ORF7)Adという構造であることが示された(図1)。

図1 Pseudomonas sp.CA10株のcar遺伝子群とコードする酵素が触媒する反応

　CARDOを発現する大腸菌を用いた休止菌体反応によりDD、DBF、dibenzothiophene(DBT)等のヘテロ環式芳香族化合物やnaphthalene、fluoranthene等の多環芳香族炭化水素(PAHs)を変換させ、機器分析により代謝物を同定を行った。その結果、CARDOはDDやDBFに対してもangulardioxygenaseとして作用すること、PAHs等に対してはcis-dihydroxylationを触媒すること、またDBTに対してはsulfoxidationを触媒することが示され、異なる種類の酸素添加反応を触媒しうるユニークな酵素であることが明らかになった。また、CARDOがangular dioxygenationを触媒する場合は、ヘテロ環式芳香族化合物のヘテロ原子が酸素あるいは窒素原子の場合に限られ、厳密な基質認識があることが示唆された。

　Gene walkingとPCRを用いたクローニングにより、P.fluorescens IP01株のcumene代謝系において、メタ開裂以降の反応を触媒する酵素遺伝子を新たに取得し、IP01株のcum遺伝子群がcumA1A2(ORF3)A3A4BCEGFHDという構造であることを明らかにした。遺伝子解析の結果、cum遺伝子群はP.putida F1株のtod遺伝子群やBurkholderia sp.LB400株のbph遺伝子群と類似の遺伝子構造を有しており、tod、bph両遺伝子群と進化的な関連があることが示唆された。

　本研究によりクローニングされたcarAaAcAdは、angular dioxygenationを触媒する酵素遺伝子の世界で最初のクローニング例である。CA10株のCARDOは、その後報告されたP.stutzeri OM1株のcarbazoleに対するangular dioxygenaseであるCarAaAcAdと98%前後のidentityを有しほぼ同一の酵素と考えられるが、他の既知のoxygenaseとは相同性が非常に低く、分子系統樹の解析からも独自に進化してきた新規な酵素であることが示された。また、基質特異性の解析から、CARDOが様々な芳香族化合物に対して酸化活性を有し、angular dioxygenation、cis-dihydroxylation、sulfoxidationの異なる酸素添加反応を触媒するユニークな酵素であることも示された。CARDOが酸化活性を有する芳香族化合物にはダイオキシン類やPAHs等深刻な環境汚染を引き起こしている化合物も多いことから、CARDOはこれらのbioremediationの有効な"tool"となりうるものと考えられる。今後、CARDOのterminal oxygenaseであるCarAaのX線結晶構造解析を行い反応中心周辺の3次元構造が明らかになれば、CARDOの特異な基質認識機構、反応機構について有用な知見が得られるものと期待される。また、その知見をタンパク質工学を用いた酵素の改変へとフィードバックすることで、さらに有用な酵素の造成も可能になるものと期待される。

　本研究で取得したcar遺伝子群のG+C含量は約52%であり、Pseudomonas属細菌の平均的なG+C含量と比較して低い値を示したことから、異なる生物からcar遺伝子群がCA10株中に転移してきた可能性が考えられた。今後、car遺伝子群の全構造とCA10株中での存在形態が明らかになれば、CAR分解代謝系のCA10株中での構築、言い換えるなら微生物の進化・適応のメカニズムに関する興味深い知見が得られるものと期待される。

　また、本研究で取得されたIP01株のcum遺伝子群の解析から、tod、bph、cum遺伝子群等の難分解系物質分解系遺伝子群が遺伝子の転移と再構成を経てオペロン構造を獲得していったことを支持する結果が改めて得られた。今後、オペロン構造の成立機構、発現制御系の進化の機構について研究を行うことで、難分解性物質分解代謝系酵素遺伝子群の造成機構についてさらなる知見が得られるものと期待される。